科研 | Mov. Disord：帕金森病人的肠道功能与微生物菌群及其代谢有关
编译：杜永凯，编辑：Emma、江舜尧。
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肠道微生物菌群由数以万亿的微生物组成，微生物群产生的各种代谢物与宿主的健康有着广泛的联系。它们对宿主健康的许多方面都有影响，包括膳食纤维的分解、维生素的产生、新陈代谢的调节和神经功能的调节。
PD(Parkinson's disease)是一种常见的神经退行性疾病，以高负担的胃肠道共病，尤其是便秘和结肠运输时间缩短，以及肠道微生物群改变为特征。现有关于PD患者的肠道菌群研究主要集中在描述患者和对照组之间的差异；肠道微生物菌群和胃肠道功能紊乱之间关系的研究很少。因此，探索PD患者中肠道微生物群与肠道功能之间的联系，可能为疾病的病因学和病理生理学提供新的理解。
作者对300例由帕金森病患者和对照样本组成的群体进行了肠道菌群组成和代谢通路的研究，并确定了肠道菌群和胃肠道特征之间新的关系。另外还对微生物菌群的测序结果和非靶向血清代谢组学的结果进行成对分析，探究在PD患者肠道中升高的、可能导致该人群中常见的胃肠道紊乱的细菌代谢物。
本研究系统的评估了帕金森病中微生物菌群组成、粪便硬度、便秘和全局性的微生物代谢物之间的关系，为更好地了解肠道微生物如何导致患者常见的胃肠道紊乱提供了新的观点。
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实验设计
1. 参与者招募
2. 数据采集
对参与者帕金森症状进行评估,包括认知水平及饮食信息。对饮食信息问卷中的项目进行归类转化，得到46种营养素和14种食物组的特定值。鉴别患者肠易激综合征(IBS)、评估便秘状态及粪便一致性。
3. 粪便样本收集和DNA提取
完成研究访问之后，收集受试者粪便样品。粪便采集试剂盒帮助提供收集时微生物群的快照。随后提取样品DNA。
4. 统计分析
用R语言对数据进行分析，比较临床变量之间关系。评估潜在干扰因子对微生物分类群和不同受试组之间关系差异的影响。评估微生物群、代谢组学和饮食数据之间两两的相关性。
5. 微生物组测序和分析
对细菌16S rDNA的V4区进行扩增。合并的文库在Illumina MiSeq平台上进行测序。原始序列处理后，利用OTU数据库进行分类组装、差异丰度分析。进行微生物共丰度的可视化，功能微生物群推断分析，代谢途径注释。
6. 丁酸盐合成能力分析
利用对粪便的DNA，分别对细菌丁酸盐合成的两条主要途径中的两个末端基因进行qPCR，直接测定和描述丁酸的产生能力。将这些基因归一化到总的16S DNA中，以量化细菌中丁酸盐的合成比例。
7. 血清代谢组学
连续获取125名受试者（包括PD患者和对照组）的非靶向代谢组学数据。提取疏水代谢物用来进行反相超性能液相色谱-质谱(MS)分析，亲水性代谢物进行亲水性相互作用液相色谱-质谱分析。
对所收集的组学数据，依据斯皮尔曼相关性在假定代谢物和微生物种群之间计算相关丰度。利用相关数据库进行微生物群显著相关的代谢物注释，并通过液相色谱-串联质谱确认相关代谢物结构。
实验结果
1. 参与者的特征
2. 评估膳食和药物
3. PD患者的微生物群改变
患者和对照组的α多样性无差异；α多样性与粪便硬度呈正相关。采用β多样性指标观察患者和对照组之间的显著成分差异（Jaccard, P< 0.001; Bray-Curtis, P < 0.001; 加权P值= 0.012，非加权P值= 0.002）。基于布里斯托尔评分的微生物群组成也有所不同（所有β多样性指标的P 值均< 0.001）。
在患者和对照组之间，有几个差异丰度类群。PD患者的微生物菌群中克里斯滕森科和脱磷孤菌科相对丰度较高，双歧杆菌、柯林斯菌属、嗜胆菌属和阿克曼属相对丰度较高。相反，患者的毛螺菌科和氏菌属以及粪肠球菌属的丰度较低。经性别、布里斯托尔评分、恩特卡朋使用和测序深度调整后，多元线性回归测试了这些菌群类别与PD状态的独立相关性，除双歧杆菌和柯林斯菌属外，所有分类单元均与PD状态显著相关，这两个菌属分别被使用恩特卡朋和布里斯托尔评分高度干扰。
4. 微生物群落结构和胃肠道功能
接下来，我们评估了微生物属/簇与胃肠道功能之间的关系。以布里斯托尔粪便一致性评分作为结肠转运时间的指标。1-2分代表便硬，有便秘倾向，3-4分正常，5-7分有腹泻倾向。对性别和测序深度进行序列逻辑回归调整，该队列前40个属中，有16个属与布里斯托尔评分显著相关，其中10个属仅在PD患者亚组中显著（图2A），而对照组中仅有2个属与布里斯托尔评分显著相关。其中大多数与较硬的大便呈正相关，但氏属菌和普氏菌属2个属在PD中常见减少，呈相反趋势。簇B显著地与较硬的粪便相关（图2B，粪便硬度与B组呈正相关）。相反，产丁酸盐的细菌（簇A）与粪便硬度呈负相关（图2C，粪便硬度与丁酸盐产生者负相关）。
PD患者中有几个类群与慢性便秘有关（DESeq2分析）。在性别和通便功能调整后，多雷亚菌、颤螺旋菌、瘤胃球菌和B簇群与便秘呈正相关，而粪杆菌属和总丁酸盐生产者（与簇A无关的）与便秘呈负相关。在对照组中没有发现类群与便秘相关，可能是因为这一组的便秘患病率较低。不出所料，相比非便秘PD患者，布里斯托尔评分在便秘的PD患者中显著较低（中位数，3分比4分；P = 2.03*105）。在PD中IBS状态的患者中，未观察到分类群丰度差异（DESeq2分析）。
图2 （A）PD患者中基于布里斯托尔评分的与粪便一致性相关的细菌的相对丰度。可视化目的下，对每个属的丰度值进行对数转换和自动缩放。（B）粪便硬度与簇B相对丰度呈正相关，（C）粪便硬度与丁酸盐产生者相对丰度呈负相。采用序数逻辑回归进行统计学意义评估。
5. 微生物群代谢和胃肠功能
考虑到PD患者中微生物群组成和胃肠道功能之间的密切关系，我们转向代谢研究，以揭示潜在的机制联系。基于PICRUSt2分析，PD患者与对照组共存在58条微生物metacyc代谢途径差异（FDR P <0.05）。对照组菌群一般富集于日常饮食中碳水化合物的降解途径，而PD患者菌群富集于与核酸降解和氨基酸代谢相关的途径。有趣的是，PD菌群也富集了2种岩藻糖降解途径；在消化道中，这种糖来自于宿主粘蛋白的N-链聚糖修饰。我们假设对照组富集了膳食淀粉的降解，导致SCFA（短链不饱和脂肪酸）的产生，这可能与正常的肠道功能有关；而PD患者组富集的岩藻糖降解，可能表明宿主黏蛋白的分解，可能与肠道功能下降有关。
为了聚焦在改变的微生物群代谢和宿主过程之间联系的特定分子，将来自75名PD患者和50名对照组的非靶向血清代谢组学数据与微生物群组成相关联。FDR校正后，58个假定代谢物与至少1个菌属/菌簇显著相关，共126个显著的微生物-代谢物相关。其中39种推测的代谢物不能被完全注释。其余的在4个检测通道以不同的离子形态中定位到8个独特的代谢物；几乎所有的分子都是肠道菌群产生的，包括对甲苯酚、苯乙酰谷氨酰胺、原儿茶酸和次级胆汁酸。这些代谢物不因性别而异。与预测的代谢途径一样，血清代谢物很容易根据其与微生物丰度的相关性聚类（图3A）。
为了评估这些代谢物与PD的潜在相关性，我们比较了患者和对照组的代谢物表达水平。其中，对甲苯酚及其硫酸化物和苯乙酰谷氨酰胺在PD患者中均显著升高（图3B）。这两种氨基酸代谢物均与多个属呈正相关，但几乎都与簇B呈极显著正相关（图3C），同时与产丁酸盐的氏菌属呈负相关。这些代谢物与帕金森病的运动/神经症状无关，也不因IBS状况而有所不同；然而，两者与患者粪便的硬度一致性和便秘严重程度显著正相关（图3D，E）。
图3 （A）细菌属与已鉴定的血清细菌代谢物的相关性。（B）PD患者对甲酚和苯乙酰谷氨酰胺水平升高，（C）对甲酚和苯乙酰谷氨酰胺与一个簇群共变微生物相关。
在PD患者中，这些代谢物与较坚固的粪便一致性（D）和便秘严重程度（E）相关。采用Mann-Whitney U检验（B）、斯皮尔曼相关性（C、E）、序数逻辑回归（D）计算统计学意义
结论
本研究报道了PD帕金森病患者肠道菌群与胃肠道特征之间显著的新关联，同时报道了与帕金森病和胃肠道功能相关的细菌和血清代谢物之间的新关联。
肠道细菌主要通过碳水化合物发酵获得能量，产生丁酸和其他SCFAs，或者通过蛋白质代谢，产生对甲酚和苯乙酰谷氨酰胺等氨基酸代谢物。菌群的成分、功能和代谢组学分析显示，PD患者的微生物菌群代谢种类向蛋白水解代谢倾斜。帕金森病的菌群组成和代谢的改变与肠道功能密切相关，提示该疾病中细菌代谢改变和肠道健康下降之间可能存在一些机制联系。系统检测帕金森病血清中有害蛋白水解性微生物代谢物的升高，提示了微生物群失调在疾病病因学和病理生理学的机制。
丁酸盐已被证明可以通过调节肠道5 -羟色胺生物合成来改善结肠运动。本研究中，我们观察到PD患者中产生丁酸盐的微生物（簇A）较少，并且丁酸盐的产生者数量与粪便硬度和便秘呈负相关。而SCFA生产功能较差的菌群B簇群（簇B）丰度显著增加。在帕金森病PD患者中，簇B显著地与较硬的粪便以及便秘正相关，较硬的粪便和便秘通常是由于结肠运输时间缩短导致的。利用布里斯托尔评分作为结肠转运时间的指标，我们发现该研究队列中的许多细菌属与粪便一致性显著相关。PD患者中细菌的丰度差异与细菌和粪便硬度的相关性之间存在高度重叠。我们在PD患者中观察到的微生物菌群分类学差异在经布里斯托尔评分调整后仍然显著，这意味着帕金森病中的微生物群改变不仅仅是硬便的结果，而是微生物群组成与肠道功能之间存在复杂的关系。
肠道菌群与结肠运输的机制关系是双向的。快速转运有助于冲洗生长缓慢的细菌；与此同时，缓慢的转运与较低的可用营养有关，这有利于生长速度较慢或能利用多种能源的细菌生长。相反，微生物群本身也可以调节肠道运动。粪菌移植可改善啮齿类动物和人的结肠慢传输情况及相关的便秘。
本研究首次平行分析了PD患者中粪便菌群组成与非靶向血清代谢物之间的相关性。肠道细菌蛋白质降解的两个为人熟知的产物——对甲酚和苯乙酰谷氨酰胺，在PD患者中升高，并且两者都与PD中升高的共丰菌群（簇B）呈正相关。此外，两者都与患者较硬的粪便和便秘严重程度高度相关。本研究还首次报道了在PD患者的脑脊液中观察到p-甲酚水平升高，p-甲酚水平在自闭症谱系障碍（另一种与肠道显著相关的神经系统疾病）中也检测到升高。
PD患者中丰度显著提升的B簇微生物与血清代谢物之间的关联尤为显著。我们观察到，PD患者血清中蛋白水解细菌性代谢物的升高（尽管饮食没有差异），另外，也观察到具备丁酸盐生产能力的微生物的丰度降低。较慢的结肠转运时间导致尿液中蛋白水解性的微生物代谢物的积累，包括本研究提到的那些。作者的结论是，较长的结肠转运时间与结肠微生物群代谢从碳水化合物发酵向蛋白水解的转变有关。我们的研究支持这一结论，并认为这种蛋白水解代谢可能是PD微生物群的一个关键特征。
肠道细菌降解的蛋白质来源可能来自消化不良的食物、脱落的上皮细胞或胃肠道中的黏液（黏蛋白）。值得注意的是，在现有的帕金森病研究（包括我们自己的研究）中，最一致的观察结果是嗜粘蛋白-艾克曼菌的升高，这是一种特征明确的粘蛋白降解者。我们还观察到PD中脱硫弧菌科的增加，该科通过细菌互生供养从宿主黏液释放的硫酸盐中获得能量。粘蛋白降解也释放糖类，如岩藻糖，可解释在PD中观察到的岩藻糖降解途径的富集。总的来说，这表明PD中肠粘膜层的异常破坏，为蛋白水解代谢产物的生成提供底物，其本身可能是有害的。
肠道内从碳水化合物发酵向蛋白水解代谢的转变被认为是有害的，因为丁酸盐是结肠细胞的重要能量来源并促进结肠运输，而生物活性氨基酸的代谢物被认为是毒素，对甲酚尤其抑制结肠细胞的氧化呼吸和增殖。因此，这种代谢变化可能与帕金森病的胃肠道紊乱有关。考虑到结肠功能障碍往往先于运动症状发展前多年，而且在PD血清中系统地检测到这些代谢物，很容易推测微生物菌群代谢方向的有害改变可能是促成该疾病的病因。