Cas9蛋白体外酶切实验介绍

　　Cas9蛋白体外酶切实验

　　实验背景:

　　CRISPR/Cas是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可特异剪切外源的病毒及DNA以对抗入侵。

　　Cas9 /gRNA系统通过sgRNA（short guide RNA）引导Cas9蛋白识别并剪切带有sgRNA靶点的双链DNA，用于基因敲除和精确编辑DNA等操作。

　　利用人工表达的Cas9蛋白和体外转录的sgRNA，可以体外切割质粒、PCR产物等双链DNA。可用于快速检测CRISPR靶点。

　　实验材料及仪器:

　　Cas9体外酶切试剂盒 （北京英茂盛业，PC1400）

　　sgRNA体外转录试剂盒（北京英茂盛业，PC1380）

　　DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京康为世纪，CW2302S）

　　DM2000 DNA marker（北京康为世纪，CW0632M）

　　仪器：37℃恒温箱；台式冷冻离心机；水平电泳槽等。

　　PCR扩增切割底物:

　　PCR扩增β-半乳糖苷酶基因中1164bp片段，命名为lac。

　　PCR扩增pUC57质粒中760bp片段，命名为57。

　　琼脂糖凝胶回收PCR产物，定量后稀释为0.2μg/μl。