Transwell小室实验步骤及方法

1.制作人工基底膜混合液

首先使用 marker 笔在 6 孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔 0.5~1cm 取出-20℃冻存的Matrigel凝胶，预置4℃融化后，按1:5将100μL Matrigel与无血清DMEM培养基混合，整个操作过程在冰上及无菌条件下进行。

2.包被基底膜

Transwell上室多孔聚碳酸酯膜滤膜上加入人工基底胶混合液50μL，37℃平铺胶化2-3h。

3.准备细胞悬液和小室

消化法从细胞培养瓶中获取细胞：消化、离心和计数后用无血清DMEM培养基制成单细胞悬液；

上室加入200μL单细胞悬液（细胞数约为1.5×105/室）；

下室加入800μL含20%FBS的DMEM;

装有Transwell小室的24孔板放置37℃、5%CO2的培养箱中培养。

4.染色和计数

培养结束，取出Transwell小室，PBS洗涤3遍（每遍5min）；

4%多聚甲醛室温固定15min,PBS洗涤3遍；

用棉签轻轻擦去上层未穿透的VSMC；

0.5%结晶紫染色15-30min，PBS洗涤3遍

风干，接下滤膜后反贴在载玻片上，用显微镜低倍镜观察，每个滤膜随机选取3个视野，高倍镜（×200）下分别计数3个视野的穿膜细胞数，计算每个视野的平均细胞数。