线粒体DNA（mtDNA）突变可导致人类一系列无法治愈的代谢疾病。这类疾病最常在母体传播，并损害细胞产生能量的能力。尽管与基因组相比，线粒体基因组中的基因数量很少，但这些突变会为遗传这些基因的人带来致命的影响。但是研究这类疾病一直很困难，因为科学家们缺乏一种方法来制作线粒体基因组具有相同突变的动物模型。因此，开发出一种可以编辑mtDNA的工具是线粒体遗传学科学家们长期奋斗的目标。那么，为什么不用“魔剪”CRISPR-Cas9？因为CRISPR-Cas9几乎可以对任何生物体中的基因进行编辑。该工具使用的RNA链可以将Cas9酶引导科学家想要编辑的DNA区域。问题来了，这对于细胞核中的DNA效果很好，但是RNA无法穿入被膜包围的线粒体。面对线粒体，“魔剪”似乎有点束手无策。2018年底，美国Broad研究所David Liu（刘如谦）了解到，华盛顿大学微生物学家Joseph Mougous带领团队发现了一个“奇怪”的酶。它是由细菌伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cenocepacia）产生的一种毒素（DddA），当它遇到DNA胞嘧啶（C）时，便将其转化为尿嘧啶（U）。由于在DNA中不常见的U就类似于T，因此可以复制细胞DNA的酶。将其复制为T，从而有效地将基因组序列中的C转换为T。David Liu此前在碱基编辑中也利用了类似的酶，但是这些酶通常只作用于单链DNA。Liu必须依靠Cas9酶来破坏双链DNA并创建一个未缠绕的单链DNA区域，使得这种酶起作用。由于它依赖于指导Cas9的RNA链，因此该技术无法到达线粒体基因组。但是，Mougous研究小组发现的DddA可以直接作用于双链DNA，而无需依靠Cas9酶来破坏它。Liu和Mougous一拍即合—— DddA可以和非CRISPR的DNA定位系统配对，实现线粒体基因组编辑。相关研究结果于7月8日发表在《Nature》杂志上。https://doi.org/10.1038/s41586-020-2477-4当然，为了让DddA用于线粒体基因组编辑，Liu和Mougous也克服了重重挑战。首先，DddA对哺乳动物细胞是有毒的。为此，研究人员将DddA的毒素区域一分为二（split-DddAtox halves），变成两个没有活性的片段。接着将这两片段分别与TALE蛋白融合，并使其与特定的DNA序列结合，只有当它们到达特定位点后相遇才激活。最后，想要将这一基因编辑工具递送到线粒体基质中，它们必须要穿过线粒体的双层膜。因此，研究团队使用线粒体靶向信号的氨基酸序列标记了构建的基因编辑工具。对于线粒体双层膜来说，这一基于蛋白的导入机制比基于RNA的导入系统（如CRISPR-Cas9）更具优势。最终，这就构建了由DddA衍生的不依赖CRISPR的线粒体碱基编辑器（DdCBE），能够实现对线粒体基因组的精准编辑，为研究和治疗线粒体相关疾病带来新的工具。所有基因组编辑工具都需要考虑脱靶效应。研究小组比较了处理过的细胞和未处理过的细胞，发现核基因组中没有偏离靶点的影响。mtDNA的脱靶活性较低。接下来，研究小组研究了DdCBE的治疗潜力，结果发现其可以修复已知49%的有害mtDNA突变。DdCBE可以减少携带mtDNA突变的比例，而不减少拷贝数。因此，当线粒体突变负荷很高时，它可能是首选甚至是唯一的选择。Liu强调，这项研究距离在临床上使用还有很长的路要走。尽管初步研究发现脱靶DNA的改变很少，但仍需要对不同细胞类型进行更多的研究。《Nature》杂志评价说，该研究成果是开发针对mtDNA疾病的基因疗法的重要进展。此外，通过使用该工具实验性地改变线粒体基因组，可以更好地了解mtDNA突变与复杂疾病、癌症和年龄相关的细胞功能障碍的相关性。
[1] Scientists make precise gene edits to mitochondrial DNA for first time.
[2] Mitochondrial genome editing gets precise.
