蜜蜂主要幼虫疾病防治新技术
作者：龙登隆1，2 姜玉锁2 徐凯1 苏文婷2 刘玉玲1 牛庆生1│文
1 吉林省养蜂科学研究所；2 山西农业大学动物科技学院
基金项目：国家蜂产业技术体系专项（CARS-44-SYZ4）；2018年度吉林省科研院所引进高层次科技创新人才资助计划；吉林省重点科技攻关项目（20160204014NY）。
作者简介：龙登隆（1993-），硕士，研究方向为蜜蜂疾病诊断与防控，E-mail：18503483531@163.com
通讯作者：牛庆生（1969-），研究员，主要从事蜜蜂资源保护与应用，E-mail：1463199779@qq.com
蜜蜂在幼虫期发病后难以控制和无法自愈，已成为养蜂者最为头疼的一类疾病。治愈不及时容易导致蜂群的群势剧烈下降而影响生产，还容易感染其他蜂群导致整个蜂场的疾病流行。现在的生产中，蜂场一旦爆发幼虫疾病，蜂农往往会优先选择抗生素治疗，但随着抗生素药物的限制或禁止使用，对幼虫疾病的防治便会束手无策。本文列举4种常见蜜蜂幼虫病的防治新技术，为日后养蜂生产中的疾病综合防治提供理论指导。
蜜蜂幼虫病是养蜂生产中蜜蜂幼虫期爆发疾病的统称，其给蜜蜂健康和养蜂生产带来巨大的危害。蜜蜂的幼虫病主要包括美洲幼虫腐臭病、欧洲幼虫腐臭病、白垩病和囊状幼虫病，这些疾病的病原具有极强的耐受性，且极易引发传染流行，一旦发病很难彻底杀灭，不及时救治可能会导致蜜蜂整群死亡。对于幼虫病，之前大多数治疗手段为使用抗生素，但抗生素的使用和滥用导致病原对抗生素产生了抗药性，且抗生素等药物的使用不仅容易造成蜂产品中药物残留，降低蜂产品品质，还会导致蜜蜂肠道菌群失衡，对蜜蜂的新陈代谢和免疫反应产生不良影响。
随着养蜂相关法律法规的颁布，抗生素在养蜂业中的使用受到严格管制，通过物理或化学灭活控制幼虫病较困难，一味的销毁只能控制疾病不再传播，并不能有效的防治，而且会造成巨大的经济损失。在新西兰，蜂农在确诊美洲幼虫腐臭病后会将销毁所有染病蜂群的蜂箱和蜜蜂。在德国，多数的防治手段为人工将未染病的成年蜜蜂从受感染的蜂群中移出后销毁蜂群，这种方法仅仅是在将成年蜜蜂保留下来以减少损失而已，这会增加养蜂生产的成本，而且并未有效地进行防治。鉴于以上，本文介绍近些年国内外利用植物天然产物、蜂产品提取物、蜜蜂肠道菌群来防治蜜蜂幼虫病的新方法，为蜜蜂幼虫病的综合防治提供新思路。
一、美洲幼虫腐臭病
1.病原和流行病学
美洲幼虫腐臭病属于细菌病，对养蜂业危害严重，其病原体是幼虫芽孢杆菌（Paenibacillus larvae）。2日龄的幼虫即会感染美洲幼虫腐臭病，但到4～5日龄时才会出现发病症状，大部分蜜蜂幼虫在封盖后死亡，尸体从白色变为淡褐色，再经咖啡色最后变为黑色。
2.防治技术
关于美洲幼虫腐臭病的研究较多，包括利用蜂胶提取物、植物精油、植物提取物以及噬菌体来抑制幼虫芽孢杆菌的生长或者杀死病原。
（1）蜂胶提取物
蜂胶有助于保护蜂群免受不同病原体的侵害，具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗炎等生物学特性。在10 mg/ml浓度下蜂胶乙醇提取物能抑制幼虫芽孢杆菌生长，这种抑制活性主要来源于蜂胶中的黄酮类、黄酮醇类、黄烷酮类和二氢黄酮醇类。Boonsai等采用琼脂扩散法分别研究了泰国蜂胶中的甲醇、二氯甲烷和正己烷提取物对幼虫芽孢杆菌生长的抑制活性，研究表明，这三种提取物中只有蜂胶的甲醇提取物表现出一定的抗菌活性。Isidorov分析了蜜蜂采自欧洲杨树、桦树的9个蜂胶样品中的化合物成分，并测试这些蜂胶对幼虫芽孢杆菌的抑制活性，发现它们对幼虫芽孢杆菌均表现出不同程度的抑制作用。
（2）植物精油
植物精油是萃取植物特有的芳香物质，其由多种化合物组成，如酚类、醛类、酮类等，这些有机化合物对广谱的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌等病原体具有极强的抗菌活性。Flesar检测了26种不同化学成分的天然化合物和19种植物提取物对幼虫芽孢杆菌的抗菌活性，发现天然化合物中血根碱抗菌效果最强。多种植物精油也可以抑制幼虫芽孢杆菌的生长，牙买加胡椒油和山胡椒油更是可以杀灭幼虫芽孢杆菌。麝香草精油对幼虫芽孢杆菌具有很好的抑制效果。
（3）植物提取物
与植物精油一样，植物提取物也具有较广的抗菌作用。蛇麻和香桃木的甲醇二氯甲烷提取物抑制幼虫芽孢杆菌的活性，且在2～8mg/ml范围内对幼虫芽孢杆菌均具有明显的抑制作用。金丝桃花中少量的二氯甲烷和甲醇提取物对幼虫芽孢杆菌的抗菌活性也很高。黑杨树芽和普通白杨树芽的提取物中的三萜化合物具有很强的抗菌能力，而黄酮类和糖苷类化合物也具有一定的抗菌能力，但活性较弱。月桂的水醇提取物也能有效的抑制幼虫芽孢杆菌生长。
（4）噬菌体
利用噬菌体治疗美洲幼虫腐臭病同样具有重要的经济和生态效益。当宿主体内出现大量特定的细菌时，在自然环境中大量存在的噬菌体会开始自我繁殖。用噬菌体来治疗美幼病，可以避免对受感染蜂巢进行的破坏性处理（如焚烧销毁），而且噬菌体具有专一性，它不会对蜜蜂、人类或其他微生物造成伤害，安全性较高。Brady等在受感染蜂群中的饲喂糖浆中加入3种噬菌体，结果发现一段时间后该蜂群竟然自愈。Yost等将7种噬菌体混合用于美幼病感染前预防和感染后的治疗，结果发现噬菌体混合物对美幼病具有一定的治疗效果，且感染前的预防效果要好于感染后的治疗效果。LeBlanc从幼虫芽孢杆菌噬菌体中分离出一种新的噬菌体溶菌素PlyPalA，其能使75%的感染幼虫恢复健康。上述研究结果均表明噬菌体治疗美洲幼虫腐臭病的有效性。
（5）有机化合物
除抑制幼虫芽孢杆菌的活性外，防止孢子萌发也是防治美洲幼虫腐臭病的有效途径，因为孢子萌发是幼虫染病的第一步。Alvarado等测试了35种吲哚类和酚类化合物对孢子萌发的抑制作用，并鉴定了其对幼虫芽孢杆菌孢子萌发的强抑制作用，发现5-氯吲哚能显著降低孢子的萌发，由此可推断，抑制幼虫芽孢杆菌孢子可能成为控制美洲幼虫腐臭病的最有效途径。
二、欧洲幼虫腐臭病
1.病原和流行病学
欧洲幼虫腐臭病也是一种细菌性疾病，由蜂房蜜蜂球菌（Melissocccus plutonius）引起。该幼虫病一般从4日龄幼虫到化蛹期随时可能死亡，大多是未封盖期间死亡。幼虫的颜色从珍珠白色逐渐变为黄色、棕色和灰黑色。病死的幼虫蜷缩于巢房底部，尸体残余物无粘性，紧粘房壁，子脾常呈“花子”现象。
2.防治技术
目前检测蜂房蜂球菌的实验室方法包括Elisa、免疫组化定位和PCR。但蜂房蜂球菌不产孢子，使用实验室培养技术很难识别，在症状明显的幼虫中也很难检测到蜂房蜂球菌。当前对蜂房蜂球菌的防治技术主要集中在蜜蜂肠道益生菌和抗菌物质等方面。
（1）蜜蜂肠道益生菌
蜜蜂胃肠道中的益生菌能引起蜜蜂免疫反应，因此将胃肠道菌群作为养蜂业疾病控制的替代制剂受到广泛关注。从蜜蜂胃中成功分离出2种乳酸杆菌属菌株：R4BT和R4C，其中R4BT对蜂房蜂球菌和幼虫芽孢杆菌均有较好的抑制作用。蜜蜂肠道分离出的乳酸杆菌饲喂给感染欧洲幼虫腐臭病的幼虫，发现其对染病幼虫治愈效果良好，表明乳酸杆菌对蜂房蜂球菌也有抑制作用。日本蜜蜂分离出一株芽孢杆菌属细菌Acja3对蜂房蜂球菌具有抑制活性，饲喂Acja3后染病幼虫死亡率降低。
（2）脂肪酸亚油酸
早期有研究发现患白垩病死亡的幼虫体内存在一种抗菌物质可以抑制蜂房蜂球菌和幼虫芽孢杆菌的生长，随后的鉴定结果发现该抗菌物质为脂肪酸亚油酸。该研究结果也带动了相关脂肪酸对欧洲幼虫腐臭病的治疗研究。Hornitzky测试28种脂肪酸对幼虫芽孢杆菌和蜂房蜂球菌培养物的抗菌活性，结果发现脂肪酸对幼虫芽孢杆菌和蜂房蜂球菌具有一定的抑制效果，其中15种脂肪酸对幼虫芽孢杆菌有抗菌作用，8种脂肪酸对蜂房蜂球菌有抗菌作用。但是后续试验发现，检测到对蜂房蜂球菌有抗菌作用的8种脂肪酸虽然有抑菌效果，但并不能对患病幼虫具有治疗效果。
三、白垩病
1.病原和流行病学
白垩病是蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）引起的真菌性疾病，导致感染的主要原因是工蜂用含有蜜蜂球囊菌孢子的食物哺育幼虫。染病幼虫尸体表面覆盖一层白色绒毛状霉菌，随着病原菌的进一步生长，虫尸不断脱水干燥，变成黑色或白色僵尸。
2.防治技术
目前治疗白垩病的方法仍然是化学物质和抗生素，但有些化学药物具有腐蚀性，不仅会污染蜂产品，还会减缓蜂王产卵的速度，而抗生素则具有残留性。而正在进行研究的包括利用蜂胶提取物、植物精油、蜜蜂胃肠道菌群以及噬菌体来抑制或者杀死病原体。
（1）植物精油
在治疗真菌疾病白垩病时，用天然的植物精油治疗白垩病变得尤为关键。Ansari利用27种植物精油进行实验发现21种精油具有抑制效果，其中胡萝卜籽、丁香花蕾和山胡椒等5种精油对蜜蜂球囊菌具有很强的抑制效果。利用桂皮、香茅精油、柠檬香茅精油和橙皮油抑制蜜蜂球囊菌，而这些精油在低浓度下都能显著抑制菌丝生长。Kloucek检测了70种挥发油，发现有39种表现出抗真菌作用。其中辣根挥发油的抑菌作用最强，牛至、大蒜和百里香精油也有一定的效果。薄荷、薰衣草等天然精油对蜜蜂白垩病病原菌也有一定的抑制作用。
（2）蜂胶提取物
由于蜂胶广泛的抗菌作用，所以蜂胶提取物也成为了控制白垩病的有效方法。Wilson发现蜂胶提取物对美洲幼虫腐臭病和白垩病具有很高的抑制作用，进一步研究发现蜂胶中5种3-酰基二氢黄酮醇对幼虫芽孢杆菌和蜜蜂球囊菌均表现出抑制活性，且在这些二氢黄酮醇类中酰基长的对幼虫芽孢杆菌抑制活性更强，酰基短对蜜蜂球囊菌的抑制活性更强。
（3）蜜蜂胃肠道微生物
蜜蜂胃肠道菌群也被研究用来抑制蜜蜂球囊菌活性。Reynaldi从蜜蜂肠道中分离出249种芽孢杆菌和类芽孢杆菌，筛选出枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和环状芽胞杆菌对蜜蜂球囊菌具有较好的抑制效果。从蜜蜂和蜜蜂肠道中分理出的三株芽孢杆菌菌株也对蜜蜂球囊菌具有较好的抑制效果。卡尼鄂拉蜂肠道分离出的枯草芽孢杆菌对蜜蜂球囊菌具有显著的抑制作用。
（4）溶菌酶
有研究发现溶菌酶同样可以抑制蜜蜂球囊菌的活性：可食用的盐酸溶菌酶对感染的幼虫进行饲喂，发现高浓度的盐酸溶菌酶能使染病蜂群恢复到感染前的水平。
四、囊状幼虫病
1.病原和流行病学
囊状幼虫病是由囊状幼虫病病毒（SBV）引起的，幼虫感染病毒后一般在5～8日龄发病。囊状幼虫病的特征是幼虫不能蛹化，虫体在死亡前由珍珠白变成淡黄色，最终变成深褐色。该病容易反复发生，一般每3～4年发生一次。
2.防治技术
目前对中蜂囊状幼虫病的防治方法不多，在蜂王卵巢和雄蜂的精液中都检测到了囊状幼虫病病毒，表明囊状幼虫病病毒可以通过自然交配由雄蜂将病毒传染给蜂王，蜂王再将病毒垂直传播传染给后代，使得防治变得更加困难。当前我国中蜂囊状幼虫病主要依靠选择抗性蜜蜂种群以及运用中药进行治疗，但是没有较好的效果，因此需要寻找新型防治方法。
（1）蜂王浆等蛋白类物质
有研究利用西方蜜蜂蜂王浆饲喂染病的中华蜜蜂幼虫发现幼虫的死亡率明显降低，这可能是两种蜂王浆的不同成分改变了蜜蜂的代谢途径，导致两种蜜蜂对病毒感染的抗性差异。Sun等人利用抗体效价为25的蛋黄免疫球蛋白Y饲喂染病蜂群，发现其对蜂群的治愈率为95%～100%。沈克飞等利用抗微生物肽SP6饲喂人工感染的中蜂囊状病幼虫，发现SP6对囊状幼虫病病毒感染中蜂有良好的防治效果。
（2）银离子
利用混合有银离子的糖水饲喂感染囊状幼虫病的蜂群，试验蜂群群势及活力均好于没有饲喂银离子糖水的对照染病蜂群，说明银离子对感染囊状幼虫病病毒的东方蜜蜂治疗是有效的。
（3）分子生物学技术
Liu等人用特定的CSBV双链RNA序列 (dsRNA)喂养蜜蜂幼虫证实了摄入CSBV衍生的dsRNA可以保护蜜蜂幼虫免受CSBV感染。随着分子生学技术的不断突破，相信在将来会成为病毒病防治的最佳方法，囊状幼虫病也会得到进一步的防治。
五、结语
随着蜜蜂幼虫病发病机制研究的不断深入，植物提取物（包括植物精油）、蜂产品提取物（蜂胶提取物和蜂王浆提取物）、噬菌体以及分子生物学技术等新防治方法也在逐渐突破，并取得一定的成果，但距离其在养蜂生产中的具体应用还有一定的差距。但随着养蜂业限制抗生素力度的加大，无毒害新方法（技术）的应用将逐渐成为蜜蜂幼虫病防治的主要防治手段。
随着蜜蜂幼虫病发病机制研究的不断深入，植物提取物（包括植物精油）、蜂产品提取物（蜂胶提取物和蜂王浆提取物）、噬菌体以及分子生物学技术等新防治方法也在逐渐突破，并取得一定的成果，但距离其在养蜂生产中的具体应用还有一定的差距。但随着养蜂业限制抗生素力度的加大，无毒害新方法（技术）的应用将逐渐成为蜜蜂幼虫病防治的主要防治手段。文章来源：《中国蜂业》2020.01期