科研 | 广药&广中医：黄连解毒汤通过调节AGEs/ RAGE/ Akt/Nrf2通路及代谢谱产生糖...
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编译：微科盟落禾，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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实验设计
实验结果
1.网络药理学预测HLJDD抗DN的潜在通路
作者从HLJDD中共鉴定出31个化合物，并进行了网络药理学研究（表S1，图S1），构建C-T-D网络，得到100个HLJDD中生物活性化合物对DN的重叠靶点（图1A）。如图1B所示，作者建立了100个潜在靶点的PPI网络，其中degree值最高（degree≥10）的10个靶点分别是PIK3R1，PIK3CA，STAT3，EGFR，Akt1，MAPK1，MAPK3，RELA，JUN，JAK2，这些靶点可能在治疗DN中发挥药理作用。
为了阐明治疗DN潜在靶点之间的关键通路，作者进行了KEGG通路富集分析。前20条通路（p<0.05）如图1C所示，包括糖尿病并发症中的AGEs/RAGE信号通路、催乳素通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等。其中14/98主节点主要集中于糖尿病并发症的AGEs/RAGE通路。因此，AGEs/RAGE通路可能与HLJDD对DN治疗作用密切相关，但仍需进一步验证。
图1 网络药理学分析
（A）复合靶点-疾病网络（橙色“V”代表HLJDD活性成分；绿色八边形表示HLJDD活性成分的靶标；红色三角形代表糖尿病肾病；蓝色椭圆代表糖尿病肾病的靶点；粉色钻石代表重叠目标）；（B） PPI网络（节点大小和颜色表示目标的度值；节点越大，从黄色到红色的度值越大）；（C） KEGG富集分析。
2. HLJDD改善db/db小鼠糖脂代谢紊乱
给药前，db/db小鼠的体重高于db/m小鼠，而HLJDD治疗4周后db/db小鼠体重明显减轻（p<0.05，图2B）。如图2C-D所示，与预期结果一致，db/db小鼠的Glu和FA水平高于db/m小鼠，但HLJDD治疗后db/db小鼠的血糖清除率显著提升（p<0.01）。此外，TC、TG、HDL-C和LDL-C是脂质代谢紊乱的四个典型特征，通过检测发现它们的水平在db/db小鼠中显著增加，HLJDD给药后TG、LDL-C水平显著降低（p<0.01）（图2E-H）。
图2 HLJDD对糖脂相关指标的影响
（A）实验设计，（B）体重，（C） Glu，（D） FA，（E） TG，（F） TC，（G） LDL-C，（H） HDL-C；n = 9。#p <0.05，##p<0.01，###p<0.001 vs Con；*p<0.05，**p< 0.01，***p<0.001vs Mod。
3. HLJDD对db/db小鼠肾脏损伤有保护作用
作者检测了与肾脏损害和功能障碍相关的临床标志物水平来评价小鼠肾脏功能，如UN、Ucr和UAER。如图3A-C所示，在db/db小鼠中UN、Ucr和UAER显著升高，而这些指标在HLJDD治疗后均达到了与对照组相似水平（p<0.05或p<0.01）。
此外，为了评估db/db小鼠肾脏病理是否改变以及HLJDD治疗是否对肾脏具有保护作用，作者采用HE、Masson和PAS染色分析小鼠肾脏组织病理损伤。如图3D所示，db/db小鼠肾脏切片HE和PAS染色显示有明显的肾小球系膜基质扩张，基底膜增厚，糖原积聚等病理改变；然而，这些症状在HLJDD治疗后均得到明显改善。Masson染色显示db/db小鼠肾小球胶原纤维明显增加，HLJDD治疗也可改善这种情况。与组织病理学结果一致，db/db小鼠纤维化相关蛋白TGF-β1表达水平显著升高（图3E），HLJDD给药后TGF-β1表达水平显著降低（p<0.01，p<0.001）。作者通过免疫组化法检测细胞特异性标记物Nephrin表达水平，用于评估肾足细胞损伤，结果显示db/db小鼠肾小球中Nephrin的表达显著降低，HLJDD治疗可显著缓解Nephrin表达水平降低（图3F）。总体上，生化和组织学结果证明，HLJDD可以预防db/db小鼠肾脏功能和结构的恶化。
图3 HLJDD对肾功能相关参数、组织病理学及免疫组化的影响
（A） UN，（B） Ucr，（C） UAER，（D） HE，Masson和PAS染色（×400）；（E） TGF-β1免疫组化及定量分析（标条：50µm）；（H） Nephrin免疫组化和定量分析（标条：50µm）。n=9；#p < 0.05，##p<0.01，###p<0.001 vs Con；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs Mod。
4. HLJDD抑制db/db小鼠AGEs/RAGE通路
如图4A和B所示，db/db小鼠血液和肾脏组织中AGEs水平明显升高（p<0.01， p<0.05）。HLJDD中、高剂量组治疗后血浆中AGEs的积累均降低（p<0.01，p<0.05），其中HDH组肾脏组织中AGEs的积累明显恢复（p<0.05）。免疫荧光和western blot分析显示，在db/db小鼠的肾脏组织中，GLO1蛋白表达主要分布在细胞核外，呈低水平表达（图4C-H）。给予HLJDD后，GLO1蛋白表达显著增加。相反，在db/db小鼠的肾脏组织中，作者观察到在细胞核外RAGE蛋白高水平表达。HLJDD治疗后，特别是高剂量组，RAGE表达水平显著下降。
图4 HLJDD抑制db/db小鼠AGEs/RAGE通路
（A）血液AGEs；（B）肾脏AGEs；（C）（D）（E） western blot分析GLO1和RAGE；（F） GLO1（红色）和RAGE（红色）免疫荧光染色，DAPI染色为蓝色，每幅图中用白色箭头勾画出GLO1和RAGE表达的代表性区域；（G）（H）免疫荧光染色定量分析GLO1和RAGE；n=3；#p<0.05，##p < 0.01，###p<0.001 vs Con；*p <0.05，**p < 0.01，***p<0.001 vs Mod。
5. HLJDD激活db/db小鼠Akt/Nrf2抗氧化通路
如图5C-E所示，db/db小鼠中SOD活性和GSH水平均显著降低（p<0.001，p<0.05），MDA水平显著升高（p<0.05），提示存在氧化应激损伤。HLJDD治疗后，SOD和GSH水平显著升高（p<0.05）。此外，db/db老鼠Akt磷酸化水平降低，而HLJDD治疗后Akt磷酸化水平显著升高（图5 F，G）。此外，Nrf2的免疫荧光染色显示db/db小鼠肾脏组织中Nrf2在细胞核的分布较db/m小鼠减少，而HLJDD干预增强了db/db小鼠肾小球中Nrf2的核易位（图5A-B）。此外，Nrf2及其下游抗氧化因子HO-1和SOD2被HLJDD干预后上调（图5F，H-J）。总的来说，这些结果表明，HLJDD可以通过激活Akt/Nrf2抗氧化途径来保护DN。
图5 HLJDD在db/db小鼠中激活Akt/Nrf2通路
（A） Nrf2免疫荧光染色分析（红色），DAPI染色为蓝色，每幅图中用白色箭头勾画出Nrf2表达的代表性区域；（B）免疫荧光染色定量分析Nrf2，（C） SOD，（D） GSH和（E） MDA；（F）（G）（H）（I）（J） western blot分析p-Akt/Akt，Nrf2，HO-1和SOD2；n=3；#p<0.05，##p<0.01， ###p<0.001 vs Con；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 vs Mod。
6. HLJDD治疗后db/db小鼠代谢谱发生变化
首先，6个QC样品和12个随机抽取的提取离子色谱图（表S2-S3）表明，LC-MS系统的重复性和稳定性满足代谢组学分析。PCA用于研究Con、Mod和HDL组之间的相互关系，确定组间明显的代谢聚类（图6A， B）。此外，图6E、F中2000X置换试验评价参数为R2=0.838、0.955、Q2=-0.311、-0.255（分别为负离子模式和正离子模式），说明OPLS-DA模型有较好的解释率和预测能力（图6C、D）。
通过OPLS-DA分析提取潜在生物标志物，并将其可视化为S图和火山图（图S2 A-D）。最后，22个代谢产物被认为是潜在的生物标志物，VIP>1， p≤0.05，其中17个被HLJDD影响恢复到control组水平（表1）。为了进一步阐明HLJDD抗DN的代谢机制，作者使用MetaboAnalyst 4.0对22个潜在的生物标志物进行代谢途径分析。结果，在尿液中确定了潜在的生物标志物参与的四种代谢途径，包括苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、葡萄糖代谢和鞘脂代谢。不同组中HLJDD对DN的潜在生物标志物水平如图S3所示。
表1 尿液中确定的受HLJDD调节的潜在生物标志物
7. 生化指标与潜在生物标志物的相关性
将8个潜在的HLJDD治疗DN的生物标志物与生化指标进行Pearson相关性分析。如图6G所示，糖脂指标（Glu、FA、TG、TC、LDL-C、HDL-C）、肾功能指标（UN、Ucr、UAER）、羰基应激指标（AGEs）与多数潜在生物标志物呈正相关，而抗氧化因子（SOD、GSH）与多数潜在生物标志物呈负相关。此外，吲哚酚硫酸酯和对甲酚硫酸酯与糖脂和肾功能指标均呈正相关。
图6 HLJDD对db/db小鼠代谢参数的影响及相关分析
（A） PCA阴性评分图；（B） PCA阳性评分图；（C） OPLS-DA阴性评分图；（D） OPLS-DA阳性评分图；（E） 2000X置换试验阴性；（F） 2000X排列阳性试验；（G）生化指标与潜在生物标志物的相关性分析（横行：潜在生物标志物；数列：生化指标。每个交叉点内的颜色表示相关效率；蓝色为负相关，红色为正相关）。
讨论
本研究综合运用网络药理学、药效学、分子生物学、代谢组学等策略，揭示HLJDD治疗DN的机制。首先，作者团队选择31个可被吸收入血的HLJDD成分进行网络药理学分析，建立成分-靶点-疾病网络，并通过PPI网络分析，确定PI3K和Akt为HLJDD治疗DN的关键靶点。此外，KEGG富集分析也显示，AGEs/RAGE途径是HLJDD对DN富集最显著的途径（图1）。
药理实验中，db/db小鼠是DN广泛使用的鼠类模型。HLJDD治疗后db/db小鼠的Glu、FA、TG和LDL-C水平均显著降低，表明HLJDD可改善糖脂代谢紊乱。此外，肾功能指标、肾脏组织病理学和免疫组化结果表明，HLJDD在体内可发挥一系列协同作用，包括改善肾功能障碍、糖原积累、损伤足细胞、抑制肾小球纤维化等。在体内和计算机上对以上结果进行详细分析发现HLJDD可改善DN糖脂代谢紊乱和肾脏损伤，AGEs/RAGE通路可能是HLJDD抗DN的关键通路。
已有研究指出，糖尿病糖脂代谢紊乱可加速甲基乙二醛（MGO）的形成，这是AGEs形成的关键前体，可通过GLO1过表达正常化。此外，AGEs在肾脏的各个部位都有积累，进一步说明AGEs在DN中具有重要作用。AGEs与RAGE的结合也已被证实可以减弱DN的发病和进展。在本研究中，db/db小鼠的血浆和肾脏中发现了高水平的AGEs积累，在HLJDD治疗后AGEs降低。免疫荧光染色和western blotting结果显示，db/db小鼠HLJDD处理后GLO1表达显著增加，RAGE表达显著降低，证实HLJDD通过抑制AGEs/RAGE通路对DN具有保护作用。同时，有报道称氧化应激可加重糖尿病及其并发症，包括DN的发病。据报道，AGEs/RAGE通路激活ROS的产生，随后诱导氧化应激，这可能有助于DN诱导的肾损伤的发病机制。根据作者的研究数据，db/db小鼠在服用HLJDD后，氧化应激相关指标（SOD、GSH、MDA）均有恢复正常的趋势，说明HLJDD可以增强db/db小鼠的抗氧化能力。
更重要的是，有报道称Akt磷酸化可上调下游20个关键抗氧化因子Nrf2、HO-1和SOD2，最终抑制氧化应激。Nrf2是一种转录因子，可激活抗氧化反应靶点（HO-1和SOD2）。这些结果与HLJDD处理后Nrf2、HO-1和SOD2的上调一致（图5），进一步证实了Akt介导的Nrf2抗氧化途径在HLJDD抗DN中发挥重要作用。综上所示，作者团队的结果首次表明，HLJDD可以通过抑制AGEs/RAGE和激活Akt/Nrf2通路来保护DN（图7）。此外，尿液中代谢物的变化表明，HLJDD对DN有潜在的保护和治疗作用。作者在db/db小鼠的尿液中共鉴定出22个潜在的HLJDD生物标志物；其中17个潜在的生物标志物在HLJDD治疗后被显著调控，主要涉及苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、葡萄糖代谢和鞘脂代谢（表1，图S3）。此前的研究表明，苯基丙氨酸和色氨酸的代谢物-对甲酚硫酸盐和吲哚酚硫酸盐是促进肾损伤的尿毒症毒素。此外，对甲酚硫酸盐在肾脏功能障碍中扮演着重要角色，可能增加活性氧的表达，进而诱发氧化应激和肾脏功能障碍，这也就解释了为什么糖脂指标（Glu，FA，TG，TC，LDL-C和HDL-C）和肾功能指标（UN，Ucr，and UAER）与对甲酚硫酸盐水平呈正相关，但SOD和GSH与对甲酚硫酸盐水平呈负相关。此外，作为吲哚的内源性代谢物，硫酸吲哚酯可通过诱导间质纤维化和肾小球硬化促进DN的进展。作者的研究显示，在db/db小鼠中，对甲酚硫酸盐和吲哚酚硫酸盐水平显著升高，提示DN的发病。经HLJDD干预后，吲哚酰硫酸盐和对甲酚硫酸盐的积累均显著降低，说明HLJDD可调节db/db小鼠苯丙氨酸和色氨酸代谢。
图7 HLJDD通过调控AGEs/RAGE/Akt/Nrf2通路改善DN的机制示意图
结论
综上所述，计算机网络药理学分析显示，AGEs/RAGE通路是HLJDD抗DN最主要的途径。体内实验表明，HLJDD可通过调节AGEs/RAGE/Akt/Nrf2通路和代谢谱改善db/db小鼠糖脂代谢紊乱和肾损伤，为HLJDD治疗DN奠定了基础。