【综述】肺孢子菌肺炎诊断方法的研究进展
文章来源： 中华结核和呼吸杂志2020,43(10):878-880
DOI：10.3760/cma.j.cn112147-20191227-00863
作者：王瑜琼 黄琳娜 詹庆元
单位：北京大学中日友好临床医学院 国家呼吸医学中心 中日友好医院呼吸与危重症医学科
摘要
肺孢子菌肺炎是一种严重的机会性感染，是人免疫缺陷病毒（HIV）感染者病死率高的重要因素。近年来，非HIV感染免疫抑制患者合并肺孢子菌肺炎的数量增多，肺孢子菌肺炎的早期、正确诊断尤为重要。本文对肺孢子菌肺炎诊断领域的研究进展进行了综述。
肺孢子菌肺炎（Pneumocystis pneumonia，PCP）是由肺孢子菌在肺部引起的一种机会性感染，70%~90%的人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染者一生可经历一次或多次PCP ［1］。近年来， 非HIV感染的免疫抑制患者中PCP的发病率升高［2, 3］，因此，寻找敏感的PCP早期诊断方法并对其进行优化尤为重要［4］。现将PCP诊断领域的研究进展综述如下。
一、微生物学检测手段
PCP的诊断金标准为合格下呼吸道标本中检出肺孢子菌。下呼吸道标本包括诱导痰、BALF、经支气管镜获得的肺组织等标本。PCP患者的痰量少，痰涂片检出率相对较低。肺组织活检可获得足够的标本，检出率高，但同时大出血及气胸的风险增高。而BALF涂片镜检的阳性率较高且安全性良好，宜作为首选方法。
肺孢子菌的实验室染色方法分传统染色和免疫荧光染色。传统染色主要包括六甲基四胺银（GMS）、甲苯胺蓝（TPO）、吉姆萨（Giemsa）、迪夫快速（Diff-Quik）及瑞氏（Wrights）染色等。GMS染色对包囊染色的特异性好，对比度强，菌体易于辨认，简便快捷，现广泛用于肺组织印片的染色，但其无法识别滋养体和囊内小体，形态不典型时易误检。TBO染色的操作简便，但无法清晰显示肺孢子菌的内部结构，现已少用。Giemsa染色和Diff-Quik染色结果不稳定，与实验人员的技术密切相关。Calcofluor-White（CFW）染色法欧美国家常用，与GMS染色相比具有简便、快速、成本低等优点。近年来建立的直接或间接免疫荧光染色是较敏感的检测方法，操作简便可行，易于辨认包囊，痰阳性率可达52%，高于GMS染色，但敏感度低于PCR法［5］。Choe等［6］的结论类似，认为痰免疫荧光染色可用于HIV合并PCP的初步诊断。
二、血清学检测手段
1. 1，3-β-D-葡聚糖（G试验）：是肺孢子菌包囊细胞壁的主要组成部分，血清G试验是诊断PCP的有效方法之一，其特点是阴性预测值较高。在非HIV感染的免疫抑制合并PCP患者中，G试验的阳性率为90%~100%［6］，敏感度和特异度为94.8%和86.3%［7］。有学者认为在HIV病例血清G试验阴性可排除PCP，但对于非HIV患者，其结果应与临床症状和影像学结合综合判断［8］。Damiani等［9］认为下呼吸道标本PCR结合G试验可区别PCP和肺孢子菌定植。
2. 表面糖蛋白：是肺孢子菌细胞壁的重要成分。Daly等［10］合成了3段覆盖Msg基因全长的重组表达片段用于检测患者体内PCMsg抗体，认为Msg用于肺孢子菌检测具有重要意义。Djawe等［10］通过酶联免疫吸附试验（ELISA）分析了110例PCP合并HIV患者（病例组）和63例其他肺炎合并HIV患者（对照组）的血清抗体对肺孢子菌主要表面糖蛋白重组片段C1（MsgC1）的反应，结果显示病例组的IgM和IgG水平明显高于对照组。健康人也可能携带肺孢子菌导致抗体检测阳性，因此确定易感人群抗体的基线水平，观察其动态变化更有意义。
3. 血乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase， LDH）：LDH升高有助于PCP的诊断，尤其对HIV患者［11］。LDH在病情进展较快时显著升高，有效治疗后下降，可动态反映PCP患者肺部炎症反应及病变的严重程度，与患者氧合指数的下降呈正相关。但LDH无特异性，作为预测参数的作用有限。
还有其他一些血清学标志物，如S-腺苷甲硫氨酸（s-adenosylmethionine，SAM）是PCP潜在的标志物，HIV合并PCP患者的SAM水平低，可能与肺孢子菌缺乏SAM合成酶有关［12］。涎液化糖链抗原是由Ⅱ型肺泡上皮细胞表达的黏液样糖蛋白，在PCP导致的肺损伤时升高，可辅助PCP的诊断。
三、核酸定量检测手段——PCR法
应用PCR技术检测呼吸道标本的肺孢子菌特异性核酸片段取材方便，检测简便，对临床诊断有重要意义［13］。
普通PCR：其敏感度为99%，特异度为91%，可检测肺孢子菌DNA，但无法区分感染或定植，主要用于排除PCP。Fan等［14］进行的荟萃分析结果表明PCR检测BALF用于诊断PCP的敏感度和特异度为91.3%~99.7%和82.7%~95.5%。由于敏感度高及定植的存在，普通PCR容易出现假阳性。
2. 巢式PCR：检测肺孢子菌基因量的最小值可达366 fg，其敏感度较高，尤其当吉姆萨染色镜检阴性时，巢式PCR仍有约65.5%的阳性率［15］。其缺点是易污染，极微量的污染可造成假阳性。
3. 定量PCR（quantitative PCR，qPCR）：其原理是荧光信号随DNA载量的增加而增加，克服了普通PCR和巢式PCR存在的不能定量和假阳性等缺点，在区别肺孢子菌定植和感染时更有优势，敏感度和特异度更高。但不同患者群体qPCR的定量阈值不同，故不能作为指导诊断或治疗的依据［16］。有学者指出，只要没有明确区分非HIV患者定植或感染PCP的阈值（只能通过qPCR实现），就不能建议用qPCR取代镜检［17］。
4. 环介导恒温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）：是一种特殊的核酸扩增方法。在扩增过程中产生一种副产物——焦磷酸镁沉淀，通过肉眼可直接确定阳性结果。LAMP法较普通PCR的敏感度更高，且不与念珠菌、曲霉等其他真菌存在交叉反应。LAMP最低检测极限是10个拷贝，比PCR高10~100倍，可用于PCP的早期诊断，尤其是对非HIV患者［18］。与巢氏PCR和qPCR相比，LAMP的敏感度和特异度稍低或相当，检出率无明显差异，但LAMP技术操作更简便，不需要昂贵的仪器，适合基层医院应用。
值得注意的是，痰标本中肺孢子菌往往成团聚集，不易检出。对于痰液和BALF涂片染色阴性的病例，可联合血清G试验，而PCR是唯一可靠的诊断措施。G试验结合qPCR能区分PCP与肺孢子菌定植。PCP发病时肺孢子菌处于快速有性繁殖扩增阶段，肺孢子菌定植时处于静止或低速无性繁殖阶段，这也是G试验结合定量PCR能区分PCP与肺孢子菌定植的理论基础［19］。
四、影像学检查
影像学检查对PCP的临床诊断极为重要，胸部高分辨率CT是首选的影像学检查方法。磨玻璃征是最常见、最早期的影像学征象，以肺门周围及双肺中、下部为主，继而出现间质改变。磨玻璃征可分为弥漫型及斑片状融合型，弥漫型多见于HIV感染者，类似肺水肿改变；斑片状融合型多见于非HIV感染者。铺路石征也是PCP常见的早期征象，是肺间质内细胞增殖导致小叶间隔增厚而形成，该征象表明肺泡和肺间质同时受累，是疾病进展的重要表现。细网格状改变也很常见，主要是间质病变加重或纤维组织增生所致，提示急性炎症吸收不良。肺气囊是PCP较有特征的表现，好发于胸膜近处肺实质内部，是由炎症或纤维化导致肺组织反复重构形成，通常较小且多发。月弓征是指病变早期或进展期在胸膜下正常肺组织形成的新月形或弓形区，代表尚未受累的肺外周组织。81%的HIV感染相关PCP患者的病变呈明显的弥漫性分布，而肾移植者仅为31%［20］。吴菊意等［21］分析HIV感染合并PCP患者早中期与晚期的CT征象发现，早中期以月弓征为特异性，而晚期则以气囊或空腔性变、纤维条索状影为典型表现。
目前，PCP尚无较好的早期诊断方法。病原学染色法敏感度低；血清抗体检测因健康人群普遍携带肺孢子菌抗体而临床诊断价值不明确；G试验为非特异性，但可作为评估PCP病情严重程度的指标；涎液化糖链抗原和LDH在PCP发病时显著升高，但只提示肺损伤的严重程度，不能作为预后的预测因素；PCR方法的敏感度最高，应考虑优先使用。符合PCP临床表现和影像学表现的患者，血清G试验升高和呼吸道标本中肺孢子菌 DNA拷贝数增加是诊断PCP的较好指标。若肺孢子菌能在体外培养成功，将对PCP的诊断产生重要影响。未来，将血清学指标与影像、PCR等联合应用，并积极寻求早期、特异、无创的新型检测方法将是PCP诊断的研究重点。