【Nature communications】m6A 甲基化的巨噬细胞重编程研究，热点必读！
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今天拆解的文献于2021年刚发表于Nature communications，影响因子是14.919。
首先我们来拆解一下【题目四要素】：RNA m6A methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming
疾病：肿瘤
表型：巨噬细胞重编程，肿瘤生长、转移
主变量：Mettl3
机制：下游变量：SPRED2；下游通路：NF-κB/STAT3信号通路
【科学假设】：
【Mettl3】的缺失损害了【YTHDF1】介导的【SPRED2】的翻译，【SPRED2】通过ERK途径增强了【NF-kB和STAT3】的激活，促进【M1/M2样肿瘤相关巨噬细胞的增加和调节性T细胞对肿瘤的浸润】，导致肿瘤【生长和转移增加】。
【知识背景】
1.巨噬细胞的分类，除了经典的M1、M2之外，还有肿瘤相关巨噬细胞、CD169＋巨噬细胞、TCR＋巨噬细胞。
巨噬细胞是天然免疫系统特化的，存活时间长，具有吞噬作用的细胞。巨噬细胞参与细胞碎片和病原体的识别、吞噬和降解。巨噬细胞还在向T细胞提呈抗原以及诱导其他抗原呈递细胞表达共刺激分子等方面发挥作用，从而启动适应性免疫反应。
肿瘤相关巨噬细胞（TAM）
从严格意义上说，TAM并不被认为是巨噬细胞中的一个亚群，因为这些细胞不是在稳态条件下存在，而是在许多肿瘤中被观察到。TAM是与特定病理情况相关的巨噬细胞，其活化状态类似M2巨噬细胞。然而，也有实验证据表明TAM不仅是一个独特的M2髓样细胞群体，而且还有同时具备M1和M2信号。
典型活化态的M1巨噬细胞
M1巨噬细胞主要通过天然和适应性免疫反应在Th1细胞募集、病原体抵抗和肿瘤控制中发挥作用。M1巨噬细胞通常由病原体、LPS、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和1型辅助性T（Th1）细胞因子干扰素γ（IFN-γ）活化。许多通路能促进巨噬细胞向M1极化，，包括IRF/STAT、LPS/TLR4和NF-κB/PI-3激酶通路。
从特征上说，M1巨噬细胞抗原呈递活性强和分泌促炎细胞因子多，如白细胞介素1（IL-1）、IL-6、TNF-α、一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）。此外，它们下调IL-12和IL-23和IL-10的表达。M1巨噬细胞的刺激导致IL-1b、TNF-α、IL-12、IL-18和IL-23的分泌水平提高。此外，M1巨噬细胞表型表达高水平的主要组织相容性复合体II类（MHCII）、CD68、CD80和CD86，以及针对Th1细胞的趋化因子，包括CXCL9和CXCL12。
替代活化型M2巨噬细胞
M2巨噬细胞可由寄生虫或真菌感染、免疫复合物、凋亡细胞、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、IL-13、TGF-b和2型辅助性T细胞因子（Th2）IL-4、IL-33和IL-25通过Th2细胞替代活化。促进巨噬细胞进入M2状态的潜在信号包括STAT6、IRF4、PPARδ和PPARγ。
与经典活化亚型相反，替代活化的亚型表达相反的表达谱：下调IL-12和IL-23，上调IL-10和IL-1RA。此外，M2巨噬细胞表达较低的炎症细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α。M2巨噬细胞在病原体清除、抗炎反应和代谢以及伤口愈合、组织重塑、免疫调节、肿瘤进展和恶性肿瘤中发挥作用。
M2表型的特点是表达CD206、CD163、CD209、FIZZ1和Ym1/2。一般来说，这种亚型高效表达吞噬作用和清除甘露糖和半乳糖所需的受体，以及能通过精氨酸酶通路增加鸟氨酸和多聚氨基酸的产生。这种类型的巨噬细胞表达的趋化因子有CCL1、CCL17、CCL18、CCL22和CCL24。
2. mRNA最常见的内部修饰之一包括了N6-腺苷酸甲基化（m6A）
m6A这种甲基化修饰是可逆化的，调控因子包括甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白等。甲基化转移酶包括METTL3/14、WTAP和KIAA1429等，主要作用是催化mRNA上腺苷酸发生m6A修饰。而去甲基化酶包括FTO和ALKHB5等，作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰。阅读蛋白主要功能是识别发生m6A修饰的碱基，从而激活下游的调控通路如RNA降解、miRNA加工等。
【数据泛读】
本文涉及生信、细胞、分子、动物四个维度，正文部分一共7张图片。
论证内容主要包括以下部分：
1. Myeloid-specific deletion of Mettl3 promotes tumour growth and metastasis.
Supplementary Figure 1 Myeloid-specific deletion of Mettl3 promotes tumour growth and metastasis.
Fig.S1a-b表达差异：将WTBMDMs（bonemarrow-derivedmacrophages，骨髓衍生的巨噬细胞）与B16细胞或B16细胞培养基共孵育，qRT-PCR与Westernblot分别检测BMDMS中Mettl3和Mettl14的RNA和蛋白表达水平，发现Mettl3的表达显著降低，而Mettl14水平没有明显差异。
Fig.S1c表达差异：B16肿瘤WT小鼠模型，分别获取从肿瘤组织分离的TAMs（肿瘤相关的巨噬细胞，CD11b F4/80 ）和来自同一宿主小鼠的BMDMs，qRT-PCR和免疫荧光结果均显示肿瘤进展期间TAMs中Mettl3的表达水平降低。
Fig.S1d-e构建Mettl3fl/flLyz2 / (WT)和Mettl3fl/flLyz2cre/
(KO)小鼠模型，后者是通过Lyz2-Cre工具鼠对髓系来源细胞中的Mettl3进行敲除，包括了巨噬细胞。分别从WT和KO小鼠中获取BMDM和PMs（腹膜巨噬细胞，peritonealmacrophages），结果显示KO小鼠的BMDMs中Mettl3mRNA表达水平降低了75％，PMs中Mettl3降低了80％。
Fig.S1fKOBMDMs中mRNAs的m6A水平低于WTBMDMS。
Fig.S1g-j构建小鼠模型：LLC细胞皮下注射到WT或Mettl3-KO小鼠中。
KO小鼠比WT小鼠表现出更快的肿瘤生长，Mettl3敲除小鼠的存活率显著缩短。
Fig.S1k-n构建模型：通过尾静脉将LLC细胞注射到WT或Mettl3-KO小鼠中。
组织学检查表明，与WT小鼠相比，KO小鼠具有较大、较多的肺转移结节，KO小鼠的整体存活率缩短。
Fig.1 Myeloid-specific deletion of Mettl3 in mice promotes B16 tumourgrowth and lung metastasis.
Fig.1a-d构建模型：B16细胞皮下注射到WT或Mettl3-KO小鼠中。
KO小鼠比WT小鼠表现出更快的肿瘤生长，KO小鼠的存活率显著缩短。
Fig.1e-f构建模型：通过尾静脉将B16细胞注射到WT或Mettl3-KO小鼠中。
体内生物成像显示与WT小鼠相比，KO小鼠中肺转移增强。
Fig.1g-k肺转移的组织学检查表明，与WT小鼠相比，KO小鼠具有较大、较多的肺转移结节，Ki67染色增加，导致KO小鼠的整体存活率缩短。
Fig.1l与正常组织中的巨噬细胞相比，METTL3的表达在TAM中降低。
Supplementary Figure 2 The KO BMDMs enhance tumour growth.
Fig.S2a-dWT或KOBMDMs用CFSE标记，并同B16或LLC细胞混合皮下注射到小鼠，接种10天后取出肿瘤组织。
结果表明，CFSE标记的细胞F4/80染色是阳性的，表明共注射的BMDMs可以在肿瘤中存活2周（Fig.S2a）。肿瘤组织中的细胞外基质也通过COL1A1染色来确定（Fig.S2b）。此外，共注射的CFSE阳性的BMDM几乎没有增殖能力（Fig.S2c）。B16或LLC细胞与KOBMDMs的共注射，肿瘤显著加速生长。
Fig.2a-cWT或KOBMDMs用CFSE标记，并同B16细胞混合皮下注射到小鼠，接种10天后取出肿瘤组织。KOBMDMs组的小鼠，肿瘤加速生长、体积和体重显著增大。
Fig.2d-fWT或KOBMDMs用CFSE标记，并同LLC细胞混合皮下注射到小鼠，接种10天后取出肿瘤组织。KOBMDMs组的小鼠，肿瘤加速生长、体积和体重显著增大。
Fig.2g-h在实验前2天用Clodronate脂质体注射WT和KO小鼠，目的是清除小鼠体内的巨噬细胞。然后，将B16细胞静脉内注射到小鼠中。生物发光成像显示，巨噬细胞耗尽后，WT和KO小鼠之间肿瘤生长和转移无差异。
Fig.2i-j巨噬细胞耗尽后，WT和KO小鼠之间肺组织转移情况无差异。
Fig.2k巨噬细胞耗尽后，小鼠的存活率延长，同时WT和KO小鼠之间的生存率无差异。
1. Mettl3 depletion in macrophages reshapes the tumour microenvironment by enhancing M1- and M2-like TAM and Treg infiltration into tumours.
Supplementary Figure 4 Mettl3 depletion in macrophages changes the immune
microenvironment in spleen and lung.
Fig.S4a-c通过流式细胞术进行脾脏和肺的免疫表型分析，
并确定KO小鼠中M1巨噬细胞（CD11b F4/80 NOS2high或CD11b F4/80 IL-12high），
M2巨噬细胞为（CD11b F4/80 ARG1high或CD11b F4/80 IL-10high）和调节T细胞（CD4 CD25 Foxp3 ）的百分比显著增加。
Fig.S4d-eKO小鼠中MDSCs(CD11b Gr1 )，CD3 CD4 和CD3 CD8 Tcells的百分比无差异。
SupplementaryFigure 5 Immune infiltration profiling in B16 tumours with scRNA-Seq.
富集B16肿瘤中的CD45 免疫浸润细胞，通过scRNA-seq分析WT和KO组分别五只小鼠，根据表达标志确定不同的免疫细胞群。
Fig.S5a揭示了23个不同的肿瘤免疫细胞群，巨噬细胞（7个细胞簇），MDSC（2个细胞簇），粒细胞（2个细胞簇），CD4 T细胞（1个细胞簇），CD8 T细胞（2个细胞簇），NK细胞（1个细胞簇），B细胞（2个细胞簇），树突细胞（DCs，2个细胞簇），血浆树突细胞（pDCs，1个细胞簇），常规树突细胞（cDC，1个细胞簇），成纤维细胞（1个细胞簇）和肿瘤细胞（1个细胞聚类）。
Fig.S5b与WT小鼠的肿瘤相比，来自KO小鼠的肿瘤显示出免疫浸润的组成的差异，其包括增加的TAMs，MDSCs和CD4 T细胞的数量，以及粒细胞和CD8 T细胞数量减少的趋势。
Fig.3a通过流式细胞术分析Mettl3-KO小鼠的B16肿瘤组织中巨噬细胞群的免疫表型，显示出M1-和M2样TAMs的总百分比增加。
Fig.3b-dMettl3-KO小鼠的B16肿瘤组织中MDSCs和调节性T细胞的百分比增加。
Fig.3e-f通过qRT-PCR和ELISA，来自B16或LLC肿瘤的Mettl3-KOTAM中，CCL22表达显著上调。
Fig.3g-k将B16细胞静脉内注射到WT和KO小鼠中。分别在Days-2,1,4,7和11注射抗CD25抗体。接受抗CD25抗体处理的WT和KO小鼠没有显示出肿瘤生长或转移的显著差异，而在未处理的组KO小鼠中观察到增加的肿瘤生长。
Fig.3lTreg细胞耗尽后，小鼠的存活率延长，同时WT和KO小鼠之间的生存率无差异。
Supplementary Figure 6 Mettl3 depletion in macrophages reshapes the tumour microenvironment by enhancing M1 and M2-like TAMs and Treg infiltration.
Fig.S6a通过流式细胞术分析Mettl3-KO小鼠的LLC肿瘤组织中巨噬细胞群的免疫表型，显示出M1-和M2样TAMs的总百分比增加。
Fig.S6bMettl3-KO小鼠的LLC肿瘤组织中MDSCs和调节性T细胞的百分比增加。
Fig.S6c-dCD3 CD4 和CD3 CD8 T细胞的百分比不受影响。
Fig.S6e-g肿瘤切片的免疫组织化学染色也产生了类似的结果
Fig.S6h通过qRT-PCR和ELISA，Mettl3敲除的BMDMs中，CCL22表达显著上调。
SupplementaryFigure 7 The impact of anti-CD25 antibody on T cells activation inB16 tumours.
Fig.S7a在B16肿瘤小鼠中鉴定抗CD25抗体耗尽Treg的效果，观察到Treg水平降低了75％。
Fig.S7b-d随着Treg细胞群的降低，Th1细胞（CD4 IFN-γ ）和IFN-γ CD8 T细胞的百分比在肿瘤中增加，而TH2细胞（CD4 IL-4 ）几乎不受影响。
Mettl3 depletion facilitates the M1 and M2 polarization of BMDMs through NF-kB/STAT3.
SupplementaryFigure 8 Mettl3 depletion promotes M1 and M2 polarization of BMDMs.
Fig.S8a-b用LPS和IFN-γ处理BMDM以诱导M1巨噬细胞，或IL-4诱导M2巨噬细胞。qRT-PCR结果表明，TNF-α，IL-6和Arg1的表达在Mettl3-KOBMDMS中明显上调。
Fig.4Mettl3 depletion facilitates the M1 and M2 polarization of BMDMsthrough NF-kB/STAT3.
Fig.4a在WT和KOBMDMs中qRT-PCR分析M1和M2巨噬细胞相关基因的表达水平，发现TNF-α，IL-6和Arg1的表达在Mettl3-KOBMDMs中明显上调。
Fig.4bELISA结果显示在Mettl3-KOBMDMs中TNF-α和IL-6表达上调，IL-10的表达无明显差异。
Fig.4c在Mettl3-KOBMDMs中也观察到增加的杀菌酶活性。
Fig.4d在Mettl3-KOBMDMs中p65和STAT3磷酸化水平增加。
Fig.4e用NF-κB抑制剂Bay-11-7082（5μM）或STAT3抑制剂S3I-201（100μM）处理的WT和KOBMDMs 8小时
Rescue：NF-κB的抑制降低了TNF-α，IL-6和ARG1的表达，同时抑制STAT3途径在WTBMDMs和KOBMDMs中降低了Arg1的表达。
Fig.4fChIP分析证明了p-STAT3特异性与Arg1的启动子结合
Fig.4g-I从小鼠肿瘤模型中分离出WT和KOTAMs。KOTAMs中M1和M2巨噬细胞相关基因的表达同时增加，这与p65和STAT3的磷酸化增强以及ARG1的表达相关。
小结：Mettl3的丧失导致NF-κB途径和STAT3信号传导的激活，导致M1和M2样巨噬细胞极化。
Tumour cells enhance the production of cytokines and activation of NF-κB and STAT3 in Mettl3-depleted macrophages.
SupplementaryFigure 10 Macrophages with Mettl3 depletion regulates cytokineresponses by communicating with tumour cells.
Fig.S10a-b用细胞因子TNF-α和IL-6分别在WT和KOBMDMs中以时间依赖性方式刺激P-P65和P-STAT3表达，同时在KOBMDMs中诱导p-p65和P-STAT3的能力比WT更明显。
Fig.S10c-eqRT-PCR分析表明，TNF-α和IL-6的表达由于TNF-α处理而增加，这通过用Bay-11-7082阻断NF-κB途径而逆转，而Arg1的表达由于IL-6处理增加，由STAT3抑制剂S3I-201逆转。
小结：NF-κB/IL-6 / STAT3信号轴在KOBMDMs中更容易激活。
Fig.S10f-h将B16或LLC细胞与BMDM培养基或BMDM一起孵育，IL-6的表达在B16和LLC细胞中上调，P65磷酸化增加。
Fig.S10i-jTNF-α处理不仅增加了P65的磷酸化，而且增加了IL-6的表达，以剂量和时间依赖性方式。
Fig.5 Production of cytokines and activation of NF-κB and STAT3 areenhanced in Mettl3-null macrophages co-cultured with tumour cells.
Fig.5aB16和LLC细胞与WT或KOBMDM培养基孵育24小时，IL-6的表达水平在B16和LLC细胞中显著上调，这通过用Bay-11-7082阻断NF-κB途径而逆转。
Fig.5b用TNF-α（40ng/ mL）或TNF-α BAY-11-7082（5μm）处理B16和LLC细胞,TNF-α处理增加肿瘤细胞中IL-6的表达，通过用Bay-11-7082阻断NF-κB途径而逆转。
Fig.5c-d将Bay-11-7082或抗TNF-α中和抗体提前与WT或KOBMDM孵育，然后再与B16或LLC细胞一起培养8h。结果表明，Bay-117082或抗TNF-α中和抗体抑制IL-6的表达，伴随P65和STAT3磷酸化减少。
Fig.5e-f在抗IL-6Ab（20μg/ml）的存在或不存在下，将B16或LLC细胞与WT和KOBMDMs中共培养。在抗IL-6Ab情况下，Arg1的表达显著下调，伴随P65和STAT3磷酸化减少。
小结：Mettl3缺陷型巨噬细胞通过调节细胞因子反应来重塑肿瘤微环境。
Loss of METTL3 impairs the YTHDF1-mediated translation of SPRED2.
Fig.6Loss of METTL3 impairs the YTHDF1-mediated translation of SPRED2.
Fig.6aWT和KOBMDMs进行MeRIP-seq分析，m6A峰的密度沿CDS的转录物稳定地增加，并且沿着3'-UTR的长度丰富度降低。
Fig.6bWT和KOBMDMs中鉴定的m6A甲基化的共有序列基序
Fig.6c-d找到BMDMs中m6A-下调基因和MAPK途径相关的功能基因的重叠基因，其中发现Spred2具有显著降低的m6a水平。
Fig.6em6A-IP结果显示，Spred2是m6A调节的靶基因。
Fig.6f在KOBMDM和TAM中，Spred2的蛋白表达减少，而mRNA水平没有明显改变。
Fig.6gmRNA衰减测定表明，m6A修饰没有明显影响Spred2的衰减。
Fig.6h分别将WT和KOBMDMs的总RNA分离成非翻译片段（<40S），翻译起始片段（包括40S核糖体，60S核糖体和80S单核糖体）和翻译活跃的多聚核糖体（>80S），进行polysomeprofiling分析。
Fig.6iqRT-PCR显示Mettl3-KOBMDMs中翻译活跃的多聚核糖体片段（>80s）中的Spred2mRNA水平明显低于WTBMDMs。
Fig.6j分析了在人和小鼠中的Spred2的保守m6A序列，并分别（Spred2-CDSmut1或Spred2-CDSmut2）或同时（Spred2-CDSmut1 / 2）突变了两个可能保守的m6a基序从GGAC至GCTC。
Fig.6kSpred2-CDS mut2和Spred2-CDSmut1/2情况下，SPRED2蛋白表达水平降低，但Spred2-CDSmut1不影响，这表明Spred2-CDSmut2中的m6A基序是表达调节的主要部位。
Fig.6lRNA-IP分析表明，与WTBMDMs相比，METTL3-KOBMDM中YTHDF1和SPRED2之间的结合显著降低。
SupplementaryFigure 11 METTL3 promotes SPRED2 translation independent of promoterbinding.
Fig.S11a双荧光素酶报告实验结果表明，METTL3野生型（WTMETTL3）和失去催化活性的METTL3突变体（MutMETTL3）均不影响荧光素酶活性，说明两者均未结合到Spred2启动子。
Fig.S11b在BMDMs中过表达WTMETTL3或MutMETTL3，证明了WTMETTL3的过表达促进了Spred2的翻译。
小结：METTL3的催化活性在Spred2的翻译中起着至关重要的作用，与启动子结合无关。
SupplementaryFigure 12 Knockdown of YTHDF1 or SPRED2 increases theexpression of Tnf-α,IL-6, Ccl22 and Arg1 through NF-kB/STAT3.
Fig.S12aYTHDF1敲低能够降低BMDMs中SPRED2的蛋白表达水平，伴随着ERK，NF-κB和STAT3磷酸化增加。
Fig.S12b-eqRT-PCR分析表明，TNF-α，IL-6，ARG1和CCL22的表达在YTHDF1敲低时增加。
Fig.S12fBMDM中的Spred2敲低导致ARG1的表达，及ERK，NF-κB和STAT3磷酸化的上调。
Fig.S12g-jqRT-PCR分析表明，TNF-α，IL-6，ARG1和CCL22的表达在Spred2敲低时增加。
Mettl3 depletion in myeloid cells impairs PD-1 blockade therapeutic efficacy in B16 melanoma.
Fig.7a-f将B16细胞静脉内注射到WT和KO小鼠中，建立B16肿瘤转移模型，在第0,3,6,9,12天注射抗PD-1抗体。在KO小鼠中，B16肿瘤对抗PD-1治疗相对有效性更小，肿瘤生长增大，和肺转移增多且缩短存活率。
小结：髓系细胞中Mettl3的缺失导致了B16肿瘤对抗PD-1治疗的耐药性。
Fig.7g在髓系细胞中消融METTL3会损害YTHDF1介导的SPRED2的翻译，YTHDF1通过调节细胞因子反应，增强促肿瘤巨噬细胞和Treg浸润，促进肿瘤进展。
【套路总结】
单变量论证
METTL3表达差异：Fig.S1a-c Fig.1l
肿瘤生长、转移表型：一反 动物实验Fig.S1g-n Fig.1a-k Fig.S2d Fig.2a-f
巨噬细胞表型和Treg表型：一反 动物实验Fig.S4 Fig.S5 Fig.S6
巨噬细胞必要性验证：Fig.S2g-k
Treg的必要性验证：Fig.3e-l
具体M1/M2极化表型：Fig.S8a-b Fig.4a-c
METTL3调节NK-ΚB/STAT3通路：Fig.4d
METTL3调节表型的通路必要性：Fig.4e-f
METTL3的临床应用意义：Fig.7
细胞交互论证（支线任务）
外源性细胞因子通过NK-ΚB/STAT3通路激活巨噬细胞：Fig.S10a-e
巨噬细胞分泌的细胞因子激活肿瘤细胞NK-ΚB/STAT3通路：Fig.S10f-j Fig.5a-b
肿瘤细胞分泌的细胞因子激活巨噬细胞NK-ΚB/STAT3通路：Fig.5c-f
三、二元调控（METTL3-SPRED2）
1.METTL3影响SPRED2的M6A水平：Fig.5c-e
2.METTL3影响SPRED2的翻译活性及蛋白水平：Fig.5f-i Fig.S11
四、二元交互（YTHDF1-SPRED2）
1.直接机制：Fig.6i
2.YTHDF1调控SPRED2及下游通路：Fig.S12a-b
3.SPRED2调控下游通路：Fig.S12f-j
【创新性】
M6A修饰是研究的热点，而本文主变量MEETL3与macrophagereprogramming相关研究仅此一篇，巨噬细胞重编程这个表型是创新点之一；同时本文直接从动物模型入手，鉴定出主变量与表型差异，相比体外实验更具有说服力和临床应用前景。
【论证逻辑】
本文论证首先在动物模型中研究主变量METTL3的表达差异，进而敲除METTL3研究其对肿瘤生长、表型的影响，单变量论证研究规范。通过论证巨噬细胞和Treg细胞的必要性，进行表型的因果嵌套，升级了研究的档次。在论证下游时着重放在METTK3对SPRED2的调控上，而YTHDF1的SPRED2交互论证较为简单。
【不足之处】
YTHDF1与SPRED2的交互验证尚不完善，METTL3如何影响YTHDF1与SPRED2交互这部分内容未知，缺乏针对SPRED2的rescue验证。