【国科报告厅】原创首发：最新农业生物技术专利—新抗虫基因、基因编辑技术、水稻Wx启动子、彩色棉花
2020年第44周篇
透过专利信息跟踪农业生物技术最新研究成果
作者：莱肯生物
很多技术和产品的创新由于各种原因无法或暂时无法发表研究论文（高影响因子论文和高价值专利评判标准的不同、保持新颖性的需要、保密技术细节的需要等），因此公开的专利信息就是跟踪最新技术和产品的重要渠道。
然而，中国的专利年申请量已接近500万件，如何从浩如烟海的专利资料中找寻到有价值的信息是一项具有挑战的工作。
本专栏将定期梳理最新公开的农业生物技术领域的发明专利，并就部分专利进行简单介绍，以为相关从业者提供有价值的信息参考。
今天让我们看看2020年第44周都公开了哪些农业生物技术相关的专利。
2020年第44周公开的部分农业生物技术专利简介
部分专利简介——
1
抗虫。
吉林农业大学申请的2020107707930专利（发明人：关淑艳; 樊书羽; 马义勇; 曲静; 姚丹; 刘思言; 王丕武; 范素杰; 刘慧婧; 刘树英; 江源; 焦鹏）涉及一种抗虫突变基因Cry2Ab‑2，本发明通过易错PCR法对Cry2Ab基因碱基序列进行随机诱变获得Cry2Ab‑2杀虫基因，Cry2Ab-2氨基酸序列第20位的Thr转换成Ala，第582位的Gly转换成Asp。用体外诱导表达的蛋白进行抗虫（粘虫）试验，结果表明该表达蛋白具有很强的杀虫活性，使粘虫致死率达88.98%，而且存活的害虫生长也严重受到抑制，与对照差异明显，可以为转基因抗虫育种的培育和工程菌株的构建提供候选基因。
九圣禾种业股份有限公司申请的2020105455827专利（发明人：舍亚涛; 高雪飞; 高翔; 舍强; 陈微林; 郭建强; 张宇; 赵海菊; 马玉龙; 孙志军）涉及一种抗虫蛋白mVIP3An18及其编码基因和应用。本发明通过生物信息学分析的结果，对VIP3抗虫蛋白进行了人工改造，包括将编码蛋白N段去除了3个天然的氨基酸并添加了46个新的氨基酸，使其在玉米细胞中的结构稳定性大大加强，避免了其被玉米内源蛋白酶的降解。再通过Gene Designer内置算法工具去除富含AT的结构域、疑似内含子结构、连续存在的重复结构域，以及其内部出现的可能会影响该基因在未来商业化应用过程中用于植物表达载体构建的常用内切酶识别位点。
先锋国际良种公司申请的2019800190577专利（发明人：J·K·巴里; 董华; R·M·格尔伯; B·彼得森-伯奇; E·谢珀斯; T·C·沃尔夫; 谢卫平; N·亚尔帕尼; 钟晓红）涉及一种杀虫蛋白IPD110多肽。该蛋白可用于防治鳞翅目、鞘翅目、双翅目、真菌、半翅目和/或线虫有害生物群体，抑制其生长或将其杀灭，并且可用于生产具有杀昆虫活性的组合物。本发明从蕨类植物维多利亚卷柏中鉴定到杀昆虫蛋白IPD110Ab，并进一步通过同源比对从其他卷柏中克隆IPD110Ab的同源蛋白，同时测试了这些蛋白对玉米穗蛾（CEW，玉米穗虫）、欧洲玉米螟（ECB，玉米螟）、秋夜蛾（FAW，草地贪夜蛾）、大豆夜蛾（SBL，大豆尺夜蛾）、黑切根虫（BCW，小地老虎）和黎豆夜蛾（VBC，梨豆夜蛾）的活性。并测试了Cry1A选择的小菜蛾的交叉抗性。同时，转化到矮菜豆中测试了对玉米穗蛾（CEW，玉米穗虫）、秋夜蛾（FAW，草地贪夜蛾）、欧洲玉米螟（ECB，玉米螟）、大豆夜蛾（SBL，大豆尺夜蛾）、和黎豆夜蛾（VBC，梨豆夜蛾）的活性；也转化到玉米中测试了IPD110Ab、Ca和Dc多肽对欧洲玉米螟（ECB，玉米螟）、玉米穗蛾（CEW，玉米穗虫）和秋夜蛾（草地贪夜蛾）的杀昆虫活性。
江苏省农业科学院申请的2020107343900专利（发明人：万群; 余向阳; 李易芯; 程金金; 吴若函）涉及吸收转运新烟碱类杀虫剂的质膜内在水通道蛋白及其编码基因与应用。本发明提供了一种小白菜质膜内在水通道蛋白及其编码基因BraPIP2；1，该质膜内在水通道蛋白具有灵敏地响应外界环境中新烟碱类杀虫剂（噻虫嗪、吡虫啉等）的特征，同时具有介导新烟碱类杀虫剂的跨膜传输的功能，促进新烟碱类杀虫剂在植株根和叶积累，在指导农药高效轻简使用、新型内吸性农药开发等方面具有重要的应用价值。
2
基因编辑。
天津吉诺沃生物科技有限公司申请的2019102758401专利（发明人：冉毅东; 高崑; 张康; 张韫玮）涉及一种获得非转基因多年生黑麦草突变体的方法。本发明通过CRISPR/Cas9系统抑制多年生黑麦草中黑麦草减数分裂蛋白编码基因LpDMC1的表达，得到不含有Cas9基因的黑麦草突变植株。利用CRISPR/Cas系统敲除DMC1后，同源染色体之间不能正常配对组装形成二价体，这样就能够获得不育植株单价体，子代杂交可形成单倍体，能够快速的缩短育种年限，在作物育种改良上起到显著的作用。
科沃施种子欧洲股份两合公司申请的2019800183944专利（发明人：A·赫梅尔; Z·瓦格齐帕瓦拉）涉及用于植物细胞基因组编辑的优化系统。本发明提供一种植物递送系统，包含Cpf1酶和向导RNA系统。该向导RNA系统的侧翼为5’端处的锤头核酶序列和3’端处的植物衍生的丁型肝炎病毒（HDV）样核酶序列。利用该Cpf1酶和向导RNA系统能够改进基因组编辑方法。
中国农业大学申请的2020105880272专利（发明人：陈其军; 逯敏慧; 姜媛媛; 柴一萍）公开了一种基因编辑的载体和方法。所述载体通过增加pegRNA表达框数量，使用聚合酶II和聚合酶III启动子共同驱动pegRNA，并结合tRNA和RNA核酶的表达策略构建而成。使用本发明的载体，进行基因编辑，尤其是植物基因编辑，可以显著提高先导编辑的效率，提高精准编辑效率。
3
水稻
扬州大学申请了一系列专利（2020100713220、2020100712961、2020100721119、2020100712834、2020100712849、2020100712957）涉及适用于水稻Wx基因表达的启动子Wxb1、Wxb3、Wxb5、Wxb6、Wxb7，它们可以作为启动子元件，用于调节水稻Wx基因表达，从而调节稻米直链淀粉含量，改良稻米蒸煮食味品质。
此外，扬州大学还申请了2020100712849专利（发明人：刘巧泉; 黄李春; 李钱峰; 张昌泉; 范晓磊），可提供一种通过改造稻米Wx基因启动子，并基于直链淀粉含量的稻米培育筛选方法。
海南波莲水稻基因科技有限公司申请的2020106588506专利（发明人：龙湍; 唐杰; 曾翔; 吴永忠; 黄培劲）涉及水稻小穗簇生突变体及其分子鉴定方法和应用。本发明提供一种水稻SPED1蛋白突变体，该突变体的第519位天冬酰胺突变为丝氨酸。该突变体是一个部分显性突变体，其纯合基因型和杂合基因型均可导致水稻植株枝梗顶端小穗的簇生，杂合基因型还可提高水稻的结实率，可用于提高杂交水稻结实率和观赏水稻的培育。
4
其他
湖南杂交水稻研究中心申请的2020106263773专利（发明人：赵炳然; 韶也; 袁定阳; 彭彦; 余东; 吕启明; 毛毕刚; 柏连阳; 袁隆平）公开了一种通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子的方法。本方法将抑制植物除草剂抗性基因表达的元件，与育性恢复基因、花粉致死基因和荧光标记基因构建四元连锁表达载体，转化入对对应类型除草剂具有抗性的不育系中，获得对对应类型除草剂敏感的繁殖系，采用对应类型除草剂对色选机筛选得到的不育系种子进行除杂，去除色选漏检的含有四元转基因元件的繁殖系种子。其中所述植物除草剂抗性基因为水稻OsHIS1基因，其对应类型除草剂为β三酮类除草剂。若所述不育系为雄性不育系，所述育性恢复基因包括EAT1（Os04g0599300）、PTC1（Os09g0449000）、TDR（Os02g0120500）或CYP704B2（Os03g0168600）；若所述不育系为雌性不育系，所述育性恢复基因为PTB1（Os05g0145000）。所述花粉致死基因元件包括Pg47启动子序列、ZMAA1基因cDNA序列和IN2-1终止子序列。所述荧光标记基因元件包括1tp启动子序列、DsRed基因cDNA序列和PINII终止子序列。
将抑制植物除草剂抗性基因表达的元件、育性恢复基因元件、花粉致死基因元件和荧光标记基因元件4个紧密连锁的基因元件转入不育系得到携带转基因的繁殖系杂合单株，携带转基因的杂合单株在自交结实过程中，携带转基因的花粉粒因花粉致死基因的作用使其败育而不能参与受精，而没有携带转基因的花粉粒与雌配子（携带转基因和未携带转基因的雌配子各一半）正常受精而结实，得到携带转基因的繁殖系和未携带转基因的不育系后代。由于携带转基因的繁殖系中还含有荧光标记基因，能够通过色选技术进行识别分选，将发荧光的繁殖系种子与不发荧光的不育系种子初步分开。然而，由于色选技术存在一定误差，色选后仍然会在不育系中掺杂进含有转基因的繁殖系，此时由于携带转基因的繁殖系中含有抑制植物除草剂抗性基因表达的元件，使得繁殖系对对应类型除草剂敏感，通过采用对应类型除草剂喷施、浸种或进行包衣处理，可以高效去除掺杂进不育系中的转基因繁殖系，进而提高了不育系（雌、雄性不育父母本）及其杂交种子的纯度。
西南大学申请的2020107545442专利（发明人：冉玲芳; 肖月华; 李耀华; 曾健晏; 王毅; 莫童; 梁爱敏; 罗明）涉及一种调控棉花纤维呈色的融合基因及其表达载体和应用。本发明利用一种可以自裂解为小片段肽的2A肽，将玉米叶片颜色基因Lc和棉花花色素合成调控基因GhPAP1组合成融合基因，采用纤维次生壁特异启动子pFbl2A启动所述融合基因在棉纤维中超量表达，得到的转基因棉纤维花青素含量较白色纤维显著提高，转基因纤维中总花青素量比白色纤维增长了4093倍，使转基因棉花产生紫红色纤维，显著拓展成熟纤维的色彩范围。
结案专利详察——
中国科学院遗传与发育生物学研究所申请的专利《一种抗稻褐飞虱的杀虫蛋白HY131c及其编码基因与应用201711039038X》于2020年10月27日获得了授权。今天就让我们详细看看这个专利。
1
发明内容
本发明公开了一种抗稻褐飞虱的杀虫蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，包括Cry1Ac的结构域I、Cry30Fa1结构域II及Cry1Ac结构域III。即，该蛋白是将Cry1Ac蛋白中的结构域II替换为Cry30Fa1蛋白的结构域II得到的蛋白质。本发明的实验证明，该蛋白对稻褐飞虱有高毒力，为水稻抗稻褐飞虱提供了新的策略，具有广阔的应用前景。
2
主张的权利
专利最初申请时主张的权利主要包括具有特定结构域组合的蛋白、核酸分子，以及相关的生物材料等。具体如下：
3
审查和答复过程
审查员审查的意见主要为：
1）说明书中的数据出现了前后矛盾（记录活虫数和LC50的时间是接虫后第6天还是第8天），致使本发明要保护的HY131c蛋白的技术效果不明确。由于技术效果不明确，本申请说明书中的相关记载不能作为判断所述技术方案技术效果的依据，而本申请实质上仅提供了效果未经验证的HY131c蛋白。
2）对比文件1（CN104387460A）公开了一种抗水稻褐飞虱的杀虫蛋白及其编码基因与应用，并指出通过对不同Cry蛋白结构域II的互换，会产生对某种害虫毒性增强的新杀虫蛋白。对比文件提供的蛋白是用Cry54Aa1结构域II替换掉Cry1Ac结构域II得到的蛋白。因此，本发明权利要求1的技术方案与对比文件1公开的技术内容相比的区别技术特征是：替换Cry1Ac结构域II的方式不同（分别使用Cry30Fa1结构域II和Cry54Aa1结构域II）。对于这一区别技术特征，对比文件2（Curr Microbiol, 58 (6): 654-9）公开了均来自BtM28菌株的Cry30Fa1和Cry54Aa1蛋白，以及Cry30Fa1氨基酸序列。而对比文件3（Genbank序列）和对比文件4（CN103937816A）也公开了Cry30Fa1的序列和结构，对比文件4还公开了Cry30Fa1蛋白具有褐飞虱抗性的功能。
申请人首先对说明书中表9的错误进行了更正，统一描述为第6天统计结果。另外，基于审查员提出的创造性问题，申请人更改了权利要求书，对蛋白的保护不是以结构域组合作为特征项，而是以序列作为特征项。修改后的权利要求为：
审查员进一步审查后认为，权利要求1中出现“包括”的表述，意味着在该蛋白序列基础上增加任意数目/种类的氨基酸均拥有与原蛋白同样的抗褐飞虱功能，而说明书仅记载了序列2有对褐飞虱的毒性，并没提供证据表明“包括”序列2所示氨基酸的所有蛋白均具有相应的功能，因此权利要求1并不能得到说明书的支持。
申请人再度对权利要求进行了修改，明确保护序列2所示氨基酸的蛋白。最终授权的权利要求如下：
该案件显示出说明书所记载内容准确、全面的重要性。审查员认为：专利制度本意追求专利权人的合法权益与社会和公众的合法权益之间的合理平衡，如果因非真实有效的信息而不当获得专利权保护，会破坏上述利益平衡，也会扰乱正常的专利工作秩序，甚至有损于社会公众对专利行政管理部分公信力的认可。作为获得专利权保护的对价，在申请文件中披露真实可信并且充分详实的技术信息是申请人的首要义务。在审查人员无法通过实践手段确认发明技术效果的情况下，通常首先基于诚信原则，推定申请文件中记载的内容真实可信，但是如果卷内证据以及被专利行政部分掌握的其他相关证据表明，涉案专利申请中所载内容或所作陈述明显存疑，将降低整个申请内容的可信度，其创造性有无也将面临更加谨慎和严格的评价。