ACS Nano：ACE芯片捕获血液外泌体并进行蛋白质标志物分析，能够快速检测胰腺癌
预计到2020年，胰腺导管腺癌（PDAC）将成为美国癌症死亡的第二大原因。PDAC常见的症状如体重减轻和上腹部疼痛都是非特异性的，容易造成患者的误诊。 PDAC的诊断目前依赖于昂贵的成像方法，如增强计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）和内镜超声，然后通过肿瘤组织活检进行确认。如果能够在PDAC进展之前就得到诊断，可能要依赖于早期诊断的液体活检新技术和新方法，会大大增加能够进行治愈性手术切除的患者比例。基于生物标志物的筛查策略有望用于早期诊断，但现有的肿瘤生物标志物，如CA19-9和癌胚抗原CEA等，既不敏感也不足以作为有效的早期诊断检测方式。目前，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（Glypican-1 ）已被确定为胰腺癌有潜在价值的外泌体生物标志物。
外泌体是小的纳米级实体，大小约70-130 nm，能从健康细胞和癌细胞中释放，进入血液和其他体液，同时携带蛋白质和核酸生物标志物。由于它们反映了原始细胞的基因型和表型，外泌体具有重要的潜力，可以在没有肿瘤组织活检的情况下针对癌症或其他疾病进行筛选。但是，由于其体积非常小且密度低，外泌体特别难以分离。常规方案依赖于超速离心法，或者仅选择一种外泌体亚型的通过外泌体表面蛋白的亲和方式来捕获。近来已经开发出一些用于快速分离和/或分析外泌体的装置的一些进展。在许多系统中，抗体用于外泌体的捕获和分析，例如使用富含外泌体但也可以存在于全细胞上的tetraspanin膜蛋白CD63和CD9。使用的检测方法包括电化学传感器，表面等离子体共振以及测量珠子上的流动机械力。这些技术中的通常会采用微流体来限制流速，比如体液中的外泌体通过纳米孔流出，然后结合抗体用于检测分离出来的外泌体。应用于该装置的患者样品必须经过过滤步骤。实际上，基于微流体分离的这种装置必须在能够满足快速诊断装置所需的标准之前，克服诸如堵塞、低流速、纯粹应力和混合问题等障碍。此外，使用特定抗体作为初始外泌体分离的选择步骤，一些对诊断至关重要的外泌体亚群可能会被忽略。另一种的方法是使用添加标记的脂质，将缓冲液样品中含有双层膜的部分连接到磁珠上。当标记的磁珠用于从人血浆中分离细胞外囊泡（EV）时，效率低于50 ％，表明血浆成分抑制了脂质结合，以及不同EV群体的脂质结合和组成存在差异，肿瘤外泌体在这方面可能有所不同。尽管已经设计了几种用于基于外泌体诊断的策略，但迄今为止，这些技术不能直接用于全血，需要稀释样品，相对耗时且目前主要只能用于研究中。 因此，适用于液体活检诊断的方法和装置仍然具有挑战。
本研究的研究人员在此前提出了一种技术，使用交流电动力学（alternating current electrokinetic，ACE）微阵列芯片装置能在15-20分钟内直接从全血、血浆或血清中分离成胶质细胞瘤外泌体和其他纳米级实体。结果表明胰腺癌和结肠癌患者样品中分离的外泌体，随后通过免疫荧光检测特异性外泌体相关蛋白生物标志物，能够全部直接在ACE微阵列芯片上（原位）进行。使用这种方法，Glypican-1和CD63可以在90分钟总时间内在未稀释的胰腺癌患者全血、血浆或血清中检测到；如果在荧光基团结合抗体允许的状态下，整个过程可以在接收患者样本的45分钟内完成（下图）。与其他外泌体分离策略不同，此方法不需要稀释或添加其他样品，如抗体、亲和珠或脂质，因为这些添加物可能与外泌体群体差异性结合或被其他污染物吸附。该方法可以很容易地适用于不同癌症或其他疾病状态的生物标志物。
图：示意图显示ACE微阵列芯片的直接免疫检测程序
是否可以使用这种快速装置来评估Glypican-1和外泌体相关生物标志物CD63的相对量？答案是肯定的。在这项发表于ACS Nano杂志的文章中，研究人员使用ACE微阵列芯片，在20分钟内从25μL未稀释的胰腺癌患者全血、血清或血浆中分离出外泌体和其他纳米级的物质（EV和cfDNA）。然后直接在芯片上进行生物标志物Glypican-1和CD63的集成免疫荧光标记和分析。定量荧光标记的生物标志物可以将PDAC患者样品集合（n = 20）与来自健康个体和来自患有良性胰腺疾病或结肠癌患者的样品进行比较。结果发现该测定能够区分PDAC患者与健康人体。此外，在部分结肠癌患者样品（n = 10）中进行实验时，该检测能够鉴定其中三种具有转移性的样品。因此，该检测方法快速准确，表明它能够作为胰腺癌或其他癌症的强大诊断工具从而得到进一步发展。
参考文献：Lewis JM, Vyas AD, Qiu Y, Messer KS, White R, Heller MJ. (2018) Integrated Analysis of Exosomal Protein Biomarkers on Alternating Current Electrokinetic Chips Enables Rapid Detection of Pancreatic Cancer in Patient Blood. ACS Nano [Epub ahead of print].
编辑：土豆
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