【新手福利】外泌体领域新手常见问题（二）

本周的周总结会在周日准时发送给大家。今天发布第二个问题集。

图片来源：Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles

随便放张图，这样可以让推文显得长一点~

长~长~长~  大家都喜欢长的么？

嘿嘿

下面是经常被问到的问题，汇总第二批。

1、用多少培液收外泌体？

培液使用量取决于细胞系。

有些细胞系外泌体释放量高，几毫升即可；有些释放量低，需要上百毫升。

一般来说一个普通的细胞系，用超离分离外泌体，第一次摸索条件，起始培液量最好50ml以上。

2、用多少血清收外泌体？

目前认为血清中外泌体的含量还是很高的。

一般常规实验血清纯化外泌体，血清起始体积再250ul到500ul。

高通量测序不同公司的要求不一样，一般在1-3ml之间。

3、为什么我超离看不到沉淀？

这种问题通常有三种可能性，

其一：使用的细胞上清或者血清量太低，从而造成了这样的结果。具体需要多少样品用去起始分离，详情见上面两个问题及回答。

其二：你使用了不透明的超速离心管，一般来说外泌体产量都比较小，所以凡是不透明的管子，基本都是很难见到明显沉淀的，你就当做有沉淀，然后操作下去即可。

其三：你使用了角转。部分品牌离心机的角转管壁粘附性很低，超离结束没多久沉淀就会滑落下去，所以请在离心结束时赶紧去收样。

4、外泌体怎么成像？

目前没有很好的外泌体体内成像方法。

有人尝试用成像染料染外泌体再用于后续的跟踪，效果其实不太好，但没有更好的办法，当你必须做体内成像的时候可以考虑用这个方法。

5、怎样抽提外泌体RNA？

有钱的组可以用微量RNA抽提试剂盒，可着劲用那些贵的效果好的即可。

没钱请用trizol配合助沉试剂，助沉试剂的选择请参考之前的推文或hzangs发布在外泌体之家论坛的在4月1日杭州使用的PPT。

外泌体之家论坛在哪？请自行百度“外泌体之家”。

6、如何拿到很纯的外泌体样品，用于蛋白质谱？

如果你要拿到很纯的，请密度梯度离心。

如果你只是想发发文章毕业，那就选一个合适的方法能做出结果就好。

7、外泌体如何鉴定，胶体金电镜是不是必须做？

外泌体的鉴定可以参考2014年ISEV发布的MISEV指南，外泌体之家论坛里有，应该在经典文献区。

一般来说电镜图和WB是必须有的，最好再配一个粒径分析。

免疫胶体金电镜一般是在研究外泌体表面蛋白的时候为了证明蛋白确实在外泌体表面才需要做的。

8、外泌体电镜是不是一定要有膜结构，无膜结构的球体对不对？

负染电镜结果中外泌体的形态肯定是那种明显的茶托样或者大饼样的！边缘有一圈略微更明亮的亮圈。如果你打到的结构是没有膜结构的圆球形，恭喜您，您很可能看到了脂蛋白颗粒或者抱团的蛋白质。

9、待提取的细胞培液如何保存，外泌体样品如何保存？

根据一些方法学相关文献的报道。细胞培液最好收集好后尽快分离其中的外泌体。两三天的话只需要放在4°即可，不建议长时间保存培液。

外泌体样品最好分离纯化后直接使用，不要进行冻融，短时间两三天放4°可以。

有文章说冷冻保存会影响外泌体形态和功能，这个有待进一步探讨，大家最好是制备后立刻使用。

10、外泌体跑WB 需不需要裂解，使用什么作为对照？

想裂就裂，不想裂就算了。都可以的。

但是请保证实验的前后一致性。如果你裂就一直裂，如果你不裂就一直都别裂。

今天就到这里。回见。O(*￣—￣*)o 让我们沐浴春风，收获paper~ 大家加油~