肺腺癌中单基因(P2RY12)免疫微环境相关分析
题目：Prognostic value and immune infiltration of a novel stromal/immune score-related P2RY12 in lung adenocarcinoma microenvironment
肺腺癌微环境中基质/免疫打分相关P2RY12的预后价值和免疫浸润情况
摘要
目的：越来越多的证据表明P2RY12属于G-蛋白偶联受体家族，在癌变过程中具有重要意义。本研究旨在研究P2RY12与肺腺癌（LUAD）肿瘤免疫微环境的关系。
流程图
结果
1. 数据的获取和整理
从UCSC Xena下载TCGA-LUAD的转录组数据，共有352例LUAD样本纳入分析（表1）。
表1 患者临床特征
2. 免疫/基质/estimate打分较低与LUAD预后较差有关
使用ESTIMATE计算LUAD的免疫/基质/estimate打分，免疫打分，基质打分和estimate打分与LUAD患者AJCC分期负相关（图1A-1C）。AJCC IV期的打分最低。以上结果表明，免疫/基质/estimate打分可以用于预测LUAD的严重程度。根据免疫/基质/estimate打分阈值，将LUAD患者分为高打分组和低打分组。免疫/基质/estimate打分较低的LUAD患者的总生存期较差（图1D-1F）。因此，免疫/基质/estimate打分较低与预后不良有关。
图1 免疫/基质/estimate打分较低与LUAD预后较差有关
3. 鉴定LUAD的免疫和基质相关DEmRNAs
差异分析表明，LUAD高免疫打分组和低免疫打分组有343个上调基因和197个下调基因（图2A）。LUAD高基质打分组和低基质打分组有452个上调基因和226个下调基因（图2B）。两组数据取交集得到145个上调基因和102个下调基因是基质和免疫相关基因（图2C和2D）。聚类分析表明，上调基因和下调基因可以将LUAD患者分为两组（图2E和2F）。
图2 鉴定LUAD的免疫/基质相关的DEmRNAs
4. LUAD的DEmRNAs的功能富集分析
为进一步研究DEmRNAs潜在的生物学过程和通路，作者进行功能富集分析。DEmRNAs富集在G蛋白偶联受体信号通路，质膜组分和信号受体活性等（图3A）。KEGG富集分析表明，DEmRNAs富集在JAK-STAT信号通路，细胞因子-细胞因子受体互作等（图3A）。其中IL2和CRLF2参与JAK-STAT信号通路（图3B）。CCL1,CCR8,CCL23,CCR6,CXCR5等DEmRNAs参与细胞因子-细胞因子受体互作（图3C）。ADRA1A,DRD5,HRT6和SSTR3参与神经敏感的配体-受体互作（图3D）。RHO, GRK1, RCVRN和CALML3参与光转导过程（图3E）。
图3 DEmRNAs的功能富集分析
5. 构建PPI网络和鉴定核心基因
使用145个上调的基质和免疫相关基因构建PPI网络（图4A），得到10个核心基因。对这145个基因进行GO和KEGG富集分析，这些基因显著富集在STAT正向调节受体信号通路，调节B细胞增殖，细胞因子-细胞因子受体互作等功能（图4B）。
图4 PPI网络
6. 鉴定生存相关的核心基因
作者进一步分析了10个核心基因的预后价值。其中CCR8,CNR2,CXCR5,GPR18和GPR31在肿瘤组织中的表达水平较高（图5A-5E）。P2RY12在肿瘤组织中的表达水平较低（图5F）。根据阈值，将LUAD样本分为高表达组和低表达组。这6个核心基因表达水平与LUAD患者的总生存期相关性如图5G-5L所示。
图5 鉴定生存相关的核心基因
7. 验证生存相关的核心基因
使用GSE31210数据集验证生存相关核心基因的表达水平和预后价值。如图6A所示，CCR8,CXCR5和GPR18在肿瘤组织中表达水平较高而P2RY12在肿瘤组织中表达水平较低。CCR8,CNR2,CXCR5,GPR18,GPR31和P2RY12的表达水平与总生存期的关系如图6B-6G所示。
图6 生存相关核心基因的验证
8. P2RY12可以作为LUAD的独立预后因子
单因素Cox回归分析表明，基质打分，免疫打分，TNM分析，AJCC分期，CCR8,GPR31,PWRY12,CNR2,GPR18和CXCR5与LUAD预后显著相关（表2）。
表2 单因素Cox回归分析
多因素Cox回归分析表明T stage，Nstage，P2RY12是LUAD的独立预后因子（图7A）。作者进一步分析了P2RY12在LUAD中的潜在功能。使用pearson相关性分析鉴定到P2RY12的共表达基因288个，对这些基因进行功能富集分析。这些基因主要参与免疫相关的生物学过程（图7B）
图7 P2RY12是LUAD的独立预后因子
9. P2RY12与免疫细胞浸润显著相关
作者进一步分析P2RY12表达水平与LUAD免疫细胞浸润的关系。表3表明P2RY12与M2巨噬细胞和树突状细胞显著相关。
表3 P2RY12与免疫细胞浸润的相关性分析
图8 P2RY12与免疫细胞浸润的相关性分析
10. P2RY12与免疫/基质/estimate打分显著相关
P2RY12与免疫/基质/estimate打分相关性分析表明，P2RY12高表达与免疫基质/estimate打分较高显著相关（图9A-9C）。结果表明，P2RY12与LUAD肿瘤免疫微环境显著相关。
图9 P2RY12与免疫/基质/estimate打分的相关性
11. LUAD中P2RY12下调表达，过表达P2RY12会抑制LUAD细胞的增殖和迁移
与正常组织相比，P2RY12在肿瘤组织中的mRNA和蛋白表达水平显著下调（图10A-10C）。免疫组化结果表明P2RY12在肿瘤组中的表达水平较低（图10D和10E）。肺癌细胞中P2RY12的表达水平较低（图10F）。为进一步研究P2RY12的作用，作者过表达P2RY12，RT-qPCR结果表明P2RY12在A549细胞中过表达，表明转染成功（图10G）。过表达P2RY12会抑制A549细胞的增殖和迁移效果（图10H-10J）。
图10 LUAD中P2RY12下调表达，过表达P2RY12会抑制LUAD细胞的增殖和迁移
结论
本研究中，作者对TCGA-LUAD的转录组数据进行分析，发现了基质和免疫相关基因P2RY12。他在肿瘤组织中低表达，其低表达与预后不良有关。此外，P2RY12与免疫细胞浸润显著相关。过表达P2RY12会抑制LUAD细胞的增殖和迁移。P2RY12可以作为一种潜在的治疗靶点和预后指标。本研究的亮点在于作者鉴定到LUAD的关键基因P2RY12并进行了实验验证。但本文还存在一定局限性，例如尚未阐明P2RY12的临床价值。