8分2区纯生信！
大家好，今天要和大家分享的是2021年1月发表的一篇文章：“Comprehensive analysis to identify DLEU2L/TAOK1 axis as a prognosticbiomarker in hepatocellular carcinoma”。
发表杂志：Mol Ther Nucleic Acids
影响因子：7.032 即时影响因子：8.6
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在这项研究中，作者旨在阐明与磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）相关的ceRNA调控网络，并鉴定与肝细胞癌（HCC）相关的潜在预后标志物。首先，作者从癌症基因组图谱（TCGA）数据库中提取了IncRNA，microRNA和mRNA的表达谱，在肝癌中构建了与PTEN相关的ceRNA网络。其次，通过在371个HCC样品中两组PTEN高表达和PTEN低表达的差异表达分析，获得了由三个差异表达的RNA构建的HCC相关lncRNA-miRNA-mRNA三重调控网络，并进行功能富集分析以评估网络在肝癌中的功能作用和潜在机制。然后，通过表达分析，生存分析和来自中枢三调控网络的RNA的核质定位分析，确定了一个与HCC预后相关的DLEU2L-hsa-miR-100-5p/hsa-miR-99a-5p-TAOK1 ceRNA网络。重要的是，作者使用相关分析在ceRNA中鉴定了DLEU2L/TAOK1轴，并通过Cox回归分析构建了临床预后模型。此外，甲基化分析表明DLEU2L/TAOK1轴异常上调可能是由于甲基化不足引起的，免疫浸润分析表明DLEU2L/TAOK1轴可能会影响肿瘤免疫微环境的变化和HCC的发生。总而言之，目前构建基于ceRNA的DLEU2L/TAOK1轴的研究可能是与HCC的诊断和预后相关的新的重要预后因素。
一、研究背景
肝细胞癌（HCC），是世界上第六大常见癌症类型和第四大致命癌症病因。据估计，2018年，全世界有841000例肝癌新发病例，其中有782000人死亡。在世界许多地区，男性的发病率高于女性。统计数据显示，HCC的5年存活率仅为18%，这表明只有30%-40%的患者能在HCC早期阶段被诊断出来。早期HCC的治疗手段包括手术切除、消融、肝移植（LT）和转动脉化疗（TACE）。然而，HCC的主要特征包括高复发率和转移率，可治愈阶段的低检出率和无效治疗。此外，在许多国家，HCC的发病率和死亡率仍在继续增加，并且已被普遍认为是预后较差且存活率降低的癌症。因此，必须探索有用的肝癌预后生物标志物或治疗靶标，以改善在HCC诊断，预防和治疗中的缺陷。磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）是人类癌症（包括HCC）中非常常见的突变抑癌基因。越来越多的证据表明PTEN活性可以通过突变，表观遗传沉默，异常蛋白质来调节，转录抑制，定位和翻译后修饰。同时，一些数据表明PTEN表达降低是HCC中的常见事件，并且与疾病分期，肿瘤等级和大小以及PTEN表达增加有关。
二、流程图
三、分析解读
1、分析PTEN在肝癌中的抑癌作用及其预后价值
①根据人类蛋白图谱（HPA）数据库调查了PTEN在肝癌中的作用。
②根据Kaplan-Meier生存曲线，研究了HCC患者中PTEN表达的临床意义。
③利用cBioPortal网站分析了PTEN的基因组和拷贝数。
结果表明：
①PTEN在正常肝组织中过表达，在肝癌组织中也存在过表达（下图A）。
②从HPA获得的免疫组织化学（IHC）染色也证明了PTEN表达的类似失调（下图B）。
③PTEN的较低表达与HCC队列患者的总体生存期差（OS）显着相关（下图C）。
④OncoPrint图显示了TCGA HCC数据集中PTEN基因的缺失（下图D）。
⑤在所有HCC样本中，有三分之一以上的样本PTEN缺失，并且其mRNA表达水平较低（下图E）。
⑥在HCC样品中发现PTEN拷贝数值与mRNA表达之间呈正相关（下图F）。
综上所述，这些数据表明在肝癌中PTEN表达被下调，并且PTEN拷贝数的缺失可能是导致肝癌患者PTEN下调的主要机制之一。
2. 鉴定差异表达基因（DEG）（DEmRNA，DElncRNA和DEmiRNA）
①使用TCGA数据库在具有PTEN高表达组和PTEN低表达组的HCC样本以及HCC和邻近正常组织中鉴定出了DElncRNA，DEmiRNA和DEmRNA。
②从具有PTEN高表达组和PTEN低表达组的HCC样本中总共筛选出860个DElncRNA（137个上调和723个下调），54个DEmiRNA（21个上调和33个下调）和1,871个DEmRNA（195个上调和1676个下调）。
③在HCC样本和正常肝组织样本之间共鉴定出3,371个DElncRNA（3,041个上调和330个下调），420个DEmiRNA（102个上调和318个下调）和8,294个DEmRNA（7,059个上调和1,235个下调）。
④可视化显示DElncRNA，DEmiRNA和DEmRNA分布的火山图（下图A-C）。
⑤热图描绘了HCC样品中PTEN高表达和PTEN低表达的15个重要可变基因的表达以及HCC和正常样本（下图D-F）。
3. lncRNA-miRNA-mRNA三重调控网络的构建
①将剩余的DE lncRNAs放入TarBase数据库中，以识别针对lncRNAs的潜在miRNA。
②然后，使用miRDB和TargetScan的数据库来参照四个DEmiRNA识别下游靶标mRNA。
③此外，寻求仅由两个数据库共享的候选mRNA，以增强预测的准确性。
④利用Cytoscape插件cytoHubba来确定集线器三重调节网络。
⑤Metascape网站进行包括GO和KEGG的共嗯那个富集分析。
结果表明：
①在8,294个DEmRNA中鉴定出373个。最后，总共包括5个lncRNA（4个上调和1个下调），4个miRNA（1个上调和3个下调）和372个mRNA（326个上调和46个下调），使用Cytoscape软件绘制HCC相关的lncRNA-miRNAmRNA三重调控网络（下图A）。
②三个lncRNA（DLEU2L，FAM99A和ARRDC1-AS1），四个miRNA（miR-99a-5p，miR-100-5p，miR-9-5p和miR-125b-5p）和六个mRNA（标识了TAOK1，HS3ST3B1，RHOQ，AGO2，BAZ2A和NR6A1（下图B）。
③参与网络的DEmRNA在“蛋白激酶活性”，“参与分化的细胞形态发生”和“GTPase结合”方面特别丰富（下图C）。
4. ceRNA网络的构建和验证以及具有HCC特异性预后价值的模型的选择
（1）分析了具有三联调控网络的枢纽RNA在具有PTEN高表达和PTEN低表达组的HCC样本以及HCC和邻近的正常肝组织中的表达水平。
结果表明：具有PTEN高表达和PTEN低表达组的HCC样品中的表达水平与癌症和癌旁组织中的表达水平相反。
①在具有PTENhigh和PTENlow表达组的HCC样本中，有一个下调（DLEU2L）和两个未分化的（ARRDC1-AS1和FAM99A）lncRNA；一个上调（miR-9-5p）和三个下调（miR-99a-5p，miR-100-5p和miR-125b-5p）的miRNA；三个下调的（TAOK1，HS3ST3B1和AGO2）和三个未分化的（RHOQ，BAZ2A和NR6A1）mRNA（下图A）。
②和HCC和邻近正常肝组织中有两个上调的（DLEU2L和ARRDC1-AS1）和一个下调（FAM99A）lncRNA；一个上调（miR-9-5p）和三个下调（miR-99a-5p，miR-100-5p和miR-125b-5p）miRNA；以及五个上调（TAOK1，RHOQ，AGO2，BAZ2A和NR6A1）和一个下调（HS3ST3B1）的mRNA。（下图B）。
为了确定这些RNA是否与HCC预后相关，作者使用Kaplan-Meier分析和对数秩检验对HCC患者进行OS分析。
结果表明：共发现一个DElncRNA（DLEU2L），两个DEmiRNA（miR-99a-5p和miR-100-5p）和三个DEmRNA（TAOK1，HS3ST3B1和RHOQ）与预后相关（下图）。
考虑到lncRNA的细胞定位决定了潜在的机制，我们通过执行lncLocator分析了三种DElncRNA的亚细胞定位。
结果表明：
①DLEU2L主要位于细胞质中，而其他两个lncRNA（FAM99A和ARRDC1-AS1）则主要分布于细胞质中（下图A）。
②构建了DLEU2L-miR-100-5p/miR-99a-5p-TAOK1 ceRNA网络（下图B）。
③TAREU和TargetScan分别预测了DLEU2L和TAOK1 3'UTR中的目标位点与miR-99a-5p和miR-100-5p配对（下图C）。
④表达相关性分析表明DLEU2L表达与TAOK1表达之间呈正相关关系（下图D）。
5. 肝癌患者中DLEU2L/TAOK1轴的临床意义
①探讨DLEU2L和TAOK1的表达与临床因素的相关性。
②为了进一步分析临床特征的预后意义，我们进行了单因素和多因素Cox回归分析以确定与OS相关的特征。
结果表明：
①在DLEU2L和TAOK1的单变量Cox回归分析模型中，TCGA队列中HCC患者的一些预后因素（TNM分期，肿瘤直径，淋巴结转移和远处转移）与OS密切相关。
②DLEU2L（HR=1.572，p=0.011）和TAOK1（HR=1.537，p=0.016）过表达水平均与不良预后显着相关。
6、甲基化与TAOK1表达的关系
①对HCC的TAOK1高表达和TAOK1低表达组之间的三种DNA甲基转移酶（DNMT1，DNMT3A和DNMT3B）进行差异表达分析。
②通过UALCAN网站对对HCC的TAOK1高表达和TAOK1低表达组之间的三种DNA甲基转移酶（DNMT1，DNMT3A和DNMT3B）进行验证。
结果表明：
①TAOK1高表达组中的DNMT1，DNMT3A和DNMT3B的表达与TAOK1low组相比显着增加（下图A）。
②对UALCAN的分析表明，正常肝组织中DNMT1的甲基化水平高于肝癌组织中的甲基化水平（p=0.101，下图B）。
③癌旁正常组织中TAOK1的甲基化水平明显高于HCC组织（p<0.0001；下图C）。
④在TAOK1的DNA序列中发现了两个甲基化位点（cg16008158和cg2570978），它们与其表达水平呈负相关（下图D）。
7、肝细胞癌中免疫浸润与TAOK1表达的相关性
通过使用TIMER进行免疫浸润与TAOK1表达的相关性分析。
结果表明：
①“SCNA”模块分析表明，几种免疫细胞浸润水平似乎与改变的TAOK1基因拷贝数有关，包括HCC中的B细胞，CD4+T细胞，巨噬细胞和树突状细胞（DC）（下图A）。
②“GENE”模块分析显示TAOK1的表达与肿瘤的纯度没有明显的相关性，但与HCC中CD4+T细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞和树突状细胞的浸润水平显着正相关（下图B）。
进一步评估了免疫浸润对HCC患者临床预后的影响
结果表明：
①高水平的CD4+细胞，巨噬细胞和嗜中性粒细胞与HCC患者的预后不良有关，其生存期少于24个月（分别为p=0.036、0.007和0.01）。这些结果表明，DLEU2L/TAOK1轴可能通过调节肿瘤浸润免疫细胞的水平来影响肝癌和临床预后。
②发现5种标记（BDCA-4[NRP1]，树突状细胞，Th1，Th2，Th17和调节性T细胞（Tregs）的STAT1，STAT6，STAT3和STAT5B与HCC中的LAYN表达呈显着正相关。
8、肝癌中与TAOK1相关的功能富集分析
利用GO和KEGG通路富集分析了肝癌中TAOK1的前200个相关基因（下图）。
结果显示：
与TAOK1相关的富集术语是有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号传导途径。此外，与TAOK1相关的GO富集分析，包括生物过程（BP），细胞成分（CC）和分子功能（MF），主要集中在“有丝分裂细胞周期相变”，“组蛋白修饰”和“激酶活性”上。
小结：
在这项研究中，作者首先通过生物信息学分析获得了包含5个lncRNA，4个miRNA和372个mRNA的lncRNA-miRNA-mRNA三重调控网络，并进行功能富集分析以评估网络在肝癌中的功能作用和潜在机制。然后，通过差异表达分析，生存分析和来自中枢三调控网络的RNA的核质定位分析，最终确定了与肝癌预后有关的DLEU2L-hsa-miR-100-5p/hsa-miR-99a-5p-TAOK1过度表达的ceRNA网络。此外，作者还发现基于ceRNA的DLEU2L/TAOK1轴可能是参与HCC的新的重要预后因素，这有助于更好地了解lncRNA-miRNA-mRNA之间的相关性，并且该预后模型对于探索HCC的发病机理是重大意义。