外周血标志物这样做还有希望发8分+SCI！
CD4+ T-cell Immunity in the Peripheral Blood Correlates with Response to Anti-PD-1 Therapy外周血CD4+T细胞免疫与抗PD-1治疗反应相关
一、研究背景
约40%的非小细胞肺癌（NSCLC）患者在抗PD-1治疗后3个月内出现早期疾病进展，可将NSCLC患者分为三个不同的亚组：无应答组，长期存活组，短期存活组。作者假设由于患者群体特异性的免疫模式，导致三个亚组对抗PD-1治疗的反应不同。
PD-1+CD8+T细胞在抗肿瘤的免疫反应中起重要作用，它可以作为预测免疫检查点抑制剂抗肿瘤反应的标志物。持久的抗肿瘤免疫需要由死亡癌细胞释放的癌抗原持续启动T细胞。抗肿瘤效应T细胞在次级淋巴器官被启动后，通过血流迁移到靶组织并且杀死癌细胞。抗原启动的T细胞，包括效应T细胞和效应记忆T细胞（EM），其特征是归巢受体（如CD62L和CCR7）的下调，使细胞迁移到次级淋巴组织。因此，CD62Llow表型已被用于识别启动的T细胞。
肿瘤引流淋巴结中分离出来的CD62LlowCD4+T细胞亚群具有强大的抗肿瘤活性。CD62LlowCD4+T细胞与Treg（CD4+CD25+FOXP3+）的比例与小细胞肺癌（SCLC）分期和预后有关。然而，尚不清楚全身性的CD4+T细胞是否在肺癌患者接受抗PD-1治疗中起作用。
二、分析流程
三、结果解读
1、应答者和无应答者中CD62LlowT细胞亚群百分比的差异
图1A 患者样本的获取流程
表1 发现队列和独立验证队列的患者的临床特征
作者选取了171例接受nivolumab治疗的NSCLC患者样本，其中有28例无可评估的PBMC样本被排除，有17例在治疗9周后无法评估抗肿瘤效果被排除。最终评估了126例样本，40例构成发现队列，86例构成独立验证队列（图1A）。发现队列和验证队列中患者的特征如表1。作者根据治疗后9周的CT评估，将患者分为两组：无应答组（早期疾病进展），以及应答组（SD（疾病稳定）、CR(完全缓解)、PR（部分缓解））。无应答（早期疾病进展）的患者生存率明显较差，而SD和PR患者生存率明显较好(补充图）。
已知CD62LlowCD4+T细胞介导了强大的抗肿瘤反应性，且肿瘤、肿瘤引流淋巴结和外周血中由CD62LlowCD44+CD69+CD90+CD27lowT-bet+CD4+T细胞亚群组成的系统性T细胞免疫是抗肿瘤免疫反应所必需的。因此，作者检测了在nivolumab治疗前NSCLC患者外周血CD4+T细胞，特别是CD62Llow亚群。
图1B-D 在达到PR或SD的应答者和无应答者中PBMC亚群的差异
在应答组患者中，CD4+T细胞群和CD8+T细胞群中CD62Llow细胞亚群百分比均显著上调（图1B&C）。无应答组患者中，CD4+T细胞群中CD25+FOXP3+细胞亚群（即Treg:CD4+CD25+FOXP3+）百分比显著上调（图1D）。
由于这两个因素（CD62Llow细胞亚群和CD25+FOXP3+细胞亚群在CD4+T细胞群的百分比）均在两组患者中存在显著差异，且CD62Llow与患者良好预后有关，CD25+FOXP3+与患者不良预后有关。因此，作者选择这两个因素，使用logistic回归模型建立nivolumab治疗反应性的预测公式。最终得到的公式近似于[-31.3+6.0*log（X2/Y）]。(X:%CD62Llow;Y:%CD25+FOXP3+)。
2、公式预测nivolumab应答
图1E-H 发现队列预测公式值和ROC曲线、患者的PFS和OS曲线
作者在含40例样本的发现队列中，根据nivolumab治疗前获得的PBMCs分析以及预测公式，将患者分为应答（X2/Y≥192）和无应答（X2/Y＜192）两组，且有应答患者的得分显著高于无应答患者(P=0.0047)（图1E）。ROC曲线表明，预测公式阈值为192时，敏感性和特异性分别为85.7%和100%（图1F）。作者还绘制了两组患者的PFS和OS曲线（图1G&H），应答组和无应答组在PFS和OS方面差异显著（P<0.0001）。
图1 I-K 独立验证队列预测公式值和ROC曲线、患者的PFS和OS曲线
作者在含86例样本的独立验证队列中，验证预测公式阈值（X2/Y＜192）能否区分队列中的无应答患者，结果发现在验证队列中，应答者的预测公式值显著高于无应答者（P=0.0008)(图1I)。于是根据该阈值将患者分为应答和无应答两组。预测公式阈值192时，敏感性和特异性分别为92.9%和72.1%（P<0.0001）。绘制两组患者PFS和OS曲线（图1J&K)，结果与发现队列一致，即两组患者OS和PFS存在显著差异，且应答患者PFS和OS显著增长(P<0.0001)。
3、CD62LlowCD4+T细胞亚群和其他T细胞亚群
目前仍未知CD62L是如何区分CD4+T细胞亚群来预测PD-1阻断治疗的抗肿瘤反应，因此，为了研究CD62LlowCD4+T细胞亚群和其他T细胞亚群的关系，作者进行了流式细胞术、质谱流式细胞术和微阵列分析。
根据T细胞的活化阶段，将T细胞分为CCR7+CD45RA+ 初始T细胞、CCR7+CD45RA-中央记忆T细胞（CM），CCR7-CD45RA- 效应记忆T细胞（EM）和CCR7-CD45RA+ 效应T细胞（EMRA）。
图2A&B 门控CD8+CD3+和CD4+CD3+上CD45RA和CCR7的表达
图2C&D CD62LlowCD4+T细胞与其他细胞亚群的关系
作者根据CCR7和CD45RA的表达，检测这四种亚群与CD62LlowCD4+T细胞的关系。结果表明，CD8+CD3+T细胞被清楚的分为四种亚群，而CD4+T细胞中缺乏EMRA亚群（CCR7-CD45RA+ ）(图2A&B)。CD62LlowCD4+T细胞亚群百分比与EM亚群（CCR7-CD45RA-）呈正相关，但与初始T细胞和CM亚群（CCR7+CD45RA+/-）呈负相关（图2C&D)。EM亚群（CCR7-CD45RA-）与Th1呈弱相关，与Th2无关。
图2E-K CD62LlowCD4+T细胞与其他细胞亚群的关系
作者检测了CD62LlowCD4+T细胞与Th1，Th2，Th17和Tfh细胞的相关性。CD62LlowCD4+T细胞与Th1(CXCR3+CCR4-CCR6-)呈显著正相关，与Th2（CXCR3-CCR4+CCR6-）呈显著负相关，与Th17(CXCR3-CCR4-CCR6+)相关性不显著，与Tfh（CXCR5+)显著正相关(图2E-H)。CD62LlowCD4+T细胞还与CD8+T细胞呈正相关，与EMRA CD8+T细胞亚群和CD62LlowCD8+T细胞亚群呈正相关（图2I-K)。
图3 CD4+T细胞质谱流式细胞分析和基因表达分析
质谱流式细胞分析显示CD62LlowCD4+簇和CCR7-CD4+簇不完全相同,CD62LlowCD4+T细胞亚群主要属于CD27-T-bet+FOXP3-CXCR3+CCR4-CCR6-亚群，即CD62L和CCR7在CD4+T细胞上的表达水平不相同（图3A）。热图展示了一系列标志物的平均表达水平，结果表明，与EM CD4+T细胞亚群（CD45RA-CCR7-CD4+）相比，CD62LlowCD4+T细胞中T-bet和CXCR3表达显著上调，CD27表达显著下调（图3B&C)。这提示属于CD62LlowCD4+T而不属于CD45RA-CCR7-CD4+的单个标志物，可以区分相对同质的CD45RA-CCR7-CD27-T-bet+CXCR3+CD4+T细胞。以上研究提示CD62Llow亚群可能包括最终分化的Th1细胞和相对不成熟的分化Th1细胞，在细胞免疫起重要作用。
图4 CD62LlowCD4+T细胞亚群与PD-1、LAG3、CTLA-4表达及树突状细胞状态的相关性
接下来，作者通过线性回归分析，检测了PD-1、LAG-3和CTLA-4表达与CD62LlowCD4+T细胞的相关性。CD62LlowCD4+T细胞，与CD62LlowCD4+T细胞上的PD-1和LAG-3表达呈显著正相关（图4A&C)，也与EM CD8+T细胞上的PD-1表达呈显著正相关（图4B）；CD62LlowCD4+T细胞与CD62LlowCD4+T细胞上的CTLA-4表达呈显著负相关（图4D）。
以上研究表明，CD62LlowCD27-T-bet+FOXP3-CXCR3+CD4+T细胞由Th1和效应CD8+T细胞组成，受PD-1调节而不受CTLA-4调节。
4、应答者和无应答者中CD62LlowCD4+T细胞基因的表达情况
图5 基因表达与nivolumab治疗的反应有关
作者使用微阵列分析，从分子水平探究了应答者和无应答者CD62LlowCD4+T细胞的差异。首先作者探究了所有患者中CD62LhighCD4+T细胞和CD62LlowCD4+T细胞基因表达的差异，发现二者具有不同的基因表达谱（图5A）。由于CCR7、CD28、TCF7在CD62LhighCD4+T细胞中高表达，这三个都是初始T细胞的标志物，因此，可以认为大部分CD62LhighCD4+T为初始T细胞。CD62LlowCD4+T细胞表达更多的AURKA、CCL17、GZMA、GZMH、ND2和IL21。接下来，作者比较了表达CD62LlowCD4+T细胞的不同临床反应患者（PR、SD和PD）之间的基因表达，发现与免疫反应相关的基因，在nivolumab治疗反应方面有显著差异。热图显示CD62LlowCD4+T细胞中基因的表达水平，结果表明应答者（PR和SD）中CLEC2A、IL7、IFNA、CXCR3和HDAC9显著表达（图5B）。
5、长期存活者与CD62LlowCD4+T细胞亚群的关系
患者分组：PFS的K-M曲线的平台在nivolumab治疗后16-18个月开始出现，因此将500天内无进展定义为长期存活者，而在治疗后超过9周均表现为PR或SD但在500天内出现疾病进展定义为短期存活者。（短期和长期存活者均在治疗9周内未出现疾病进展，为应答组患者；而治疗9周内出现疾病进展为无应答组患者。）
图6 长期存活者和短期存活者CD62LlowCD4+T细胞亚群的比较
在nivolumab治疗后，作者将患者分为长期存活组和短期存活组，分别检测两组患者的CD4+T。与短期存活组的患者相比，长期存活组患者的CD62LlowCD4+T细胞数目显著增加，预测公式的值也显著增加（图6A&B)。
接下来，为了评估抗PD-1治疗的效果，作者在nivolumab治疗后检测了患者的外周血。惊讶的是，在治疗后四周，应答组患者的CD62LlowCD4+T细胞数目显著下降，而无应答组患者无此现象（图6C&D)。可能的原因是，有效的抗PD-1治疗可能激活免疫编辑过程，导致癌症相关抗原丢失，从而导致CD4+T细胞消耗。
治疗12-92周内均持续应答的患者CD62LlowCD4+T细胞数目较高，预测公式的值较高；期间出现抵抗的患者CD62LlowCD4+T细胞数目下降，预测公式的值下降（图6E&F）。最后作者进行ROC分析，发现预测公式阈值为323.5时，敏感性和特异性分别为68.2%和81.7%。因此nivolumab治疗前检测外周血CD4+T细胞可预测抵抗反应和长期存活者。治疗前表现出高比例CD62LlowCD4+T细胞并持续保持该亚群的患者往往存活500天以上而无疾病进展。在治疗中添加CD62LlowCD4+T细胞亚群可能改善治疗效果。
小结
作者根据nivolumab治疗反应性将NSCLC患者分为应答组和非应答组，发现应答组患者CD62LlowCD4+T细胞数目较高，Treg数量较少。作者以两种细胞的数量为因素构建了nivolumab治疗反应性的预测公式，并在验证队列评估了该公式。通过探究CD62LlowCD4+T细胞亚群与其他T细胞亚群的相关性，作者发现CD62LlowCD4+T细胞与Th1和PD-1+CD8+T细胞有关。随后作者探究了患者CD62LlowCD4+T细胞基因的表达水平。最后，作者发现CD62LlowCD4+T细胞与患者长期存活率有关，可以用预测公式在治疗前评估患者反应性，支持对含高CD62LlowCD4+T细胞数目的患者采用抗PD-1治疗。
局限性：由于肿瘤样本量小，未检测CD62LlowT细胞的抗原特异性。