0.1M盐酸溶液可加速促进dECM生物墨水制备

近期，由北京大学第三医院运动医学科领导的研究团队在《Acta Biomaterialia》杂志上发表题为“Comparison of three different acidic solutions in tendon decellularized extracellular matrix bio-ink fabrication for 3D cell printing ”的论文，比较了三种酸性溶液0.5M醋酸（AA）、0.1M盐酸（HA）和0.02M盐酸（HA）在肌腱衍生的脱细胞胞外基质（Decellularized extracellular matrix ，dECM）生物墨水用于3D细胞打印的生物制备中的应用，研究表明0.1M HA能加快dECM粉末的消化速度，使得其制作的dECM水凝胶的刚度降低，变得更柔软，可促进包被细胞的扩散和增殖，表现出更好的肌腱诱导能力。

dECM水凝胶由于具有良好的细胞相容性和仿生特性，在3D细胞打印生物墨水中的应用日益受到重视。生物墨水的渗透压和刚度是影响打印细胞生物学功能的重要因素，然而对dECM在这方面的关注却很少，这项研究首先比较了三种常用酸性溶液在肌腱dECM水凝胶制备中的消化状况，然后比较了三种肌腱衍生的dECM水凝胶的渗透压和流变特性，再将干细胞与三种肌腱来源的dECM水凝胶结合，用于3D生物打印。

图1. 研究设计示意图

3D细胞打印

首先，研究人员制备猪肌腱脱细胞及dECM粉末，之后通过添加3mg/mL胃蛋白酶在0.5M AA，0.1M HA或0.02M HA溶液中酶解制备dECM生物墨水。同时提取鼠骨髓间充质干细胞，并做成骨、成脂、成软骨细胞三系分化鉴定。再将第三代BMSCs的细胞悬液与中和的dECM生物墨水混合，给0.5M AA、0.1M HA和0.02M HA制的生物墨水设定印刷压力，生物打印速度均设定为15毫米/秒。在直径6cm的细胞培养皿上打印层距100μm、20×20mm的三层网格结构。打印的细胞负载结构在37°C和5%的二氧化碳中孵育，并分别于第3、6、9、13天更换培养皿培养液（图2）。

图2. 在不同印刷头速度下，每个组的形状保真度值

三种生物墨水打印效果比较

研究人员评估了加入培养基前细胞被水凝胶包裹的时间对三种dECM水凝胶细胞活力的影响。0.5M AA组在加入细胞培养基前，随着包封时间的增加，打印细胞的活力明显下降，这可能与它对细胞的渗透压冲击有关；0.1M HA组和0.02M HA组30min内细胞存活率均在90%以上，60min后细胞存活率开始下降。细胞存活率的下降可能与其他更复杂的问题有关，如温度和氧化状态。然而，这两种类型的生物墨水在水凝胶封装120min后，细胞存活率甚至高于75%（图3）。

图3. dECM水凝胶包封时间对细胞存活率的影响

其次，研究人员对三种类型的dECM生物墨水在两周内6个时间点的细胞存活率（图4）和细胞增殖（图5）进行了评估和比较，0.5M AA组在第10天，细胞存活率64±5%；0.1M HA组和0.02M HA打印后10天和14天，其中0.1M HA组的打印细胞挤在一起，活率高细胞密度更大。

图4. 三种dECM生物墨水两周内的细胞存活率

图5. 三种dECM生物墨水打印细胞的增殖试验

再次，研究人员对BMSCs在三组生物墨水中扩散进行了对比分析，扩增第14天0.1M HA组的细胞群的扩展长度最大，部分打印细胞的展布长度甚至超过100μm，0.5M AA和0.02M HA组的伸展长度均低于0.1M HA组。另外0.1M HA组打印后4天大幅收缩，打印后25天，打印的组织大约只有原来大小的四分之一，其他两组无收缩现象。这可能是因为0.1M HA组制成的水凝胶刚度很低，另一个原因可能是凝胶速率较低，这导致了胶原纤维网络的不稳定结构（图6）。

图6. 三种dECM生物墨水打印细胞扩散试验

最后，研究人员用RT-PCR法从基因水平阐明三种dECM水凝胶对BMSCs成腱分化的影响，0.1M HA制成的dECM生物墨水打印的BMSCs与对照组相比，Scx、Tnc、COL1和Tnmd mRNA表达明显升高。虽然在其他两组中肌腱相关基因的表达也有升高的趋势，但只有一些差异是显著的。可能是因为对照组是商业化的I型胶原生物墨水(来自牛皮组织)，具有良好的致健能力（图7）。

图7. 三种类型dECM生物墨水包裹的BMSCs基因表达趋势

结论

0.1M盐酸的低pH值可以加速dECM粉末的消化过程。这可以使dECM水凝胶更加柔软，其存储模量小于100Pa，这种柔软的dECM水凝胶促进了被其包裹的干细胞的扩散和增殖。与其他两种更硬的dECM水凝胶相比，它也表现出更好的肌腱诱导能力。但这种过度消化的dECM水凝胶更不稳定，随着培养时间的延长它会收缩，因此在dECM生物墨水制备过程中，选择合适的酸性溶液类型和浓度是必要的。消化时间、酸性溶液的强度以及dECM粉末的大小和浓度之间应保持平衡。

原文检索：

Fengyuan Zhao, Jin Cheng, Jiahao Zhang, Huilei Yu, Wenli Dai, Wenqiang Yan, Muyang Sun, Guocheng Ding, Qi Li, Qingyang Meng, Qiang Liu, Xiaoning Duan, Xiaoqing Hu, Yingfang Ao.Comparison of three different acidic solutions in tendon decellularized extracellular matrix bio-ink fabrication for 3D cell printing.Acta Biomater. 2021 Sep 1;131:262-275. doi: 10.1016/j.actbio.2021.06.026. Epub 2021 Jun 23.