CaVα2δ——一种新型的自身免疫性脑炎抗体

自身免疫性脑炎

自身免疫性脑炎是一类由自身免疫机制介导的脑炎，主要由抗体介导的神经元或突触出现功能障碍，从而导致的边缘性脑炎、脑干脑炎、小脑炎或脑脊髓炎。自2007年发现抗N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）脑炎以来，已经鉴定出多种新的自身抗体，如抗富含亮氨酸的胶质瘤灭活1（LGI1）、抗接触蛋白相关蛋白2（Caspr2）、抗γ-氨基丁酸（GABA）受体、抗α-氨基3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸（AMPA）受体和抗二肽基肽酶样蛋白-6（DPPX）抗体。许多自身免疫性脑炎患者在目前的诊断中没有检测到抗体，可能是因为存在尚未发现的隐藏抗体。在没有抗体阳性的情况下，自身免疫性脑炎的诊断是建立在排除病毒和其他病因的基础上的，因此治疗容易被推迟。检测新抗体有助于精确免疫治疗和早期免疫治疗，有助于改善自身免疫性脑炎的最终结局。氨基酸受体和电压门控离子（钙离子和钾离子）通道是自身免疫性脑炎的主要靶点。LGI1、Caspr2和DPPX抗体靶向调控电压门控K+通道复合体的相邻蛋白或亚单位。就电压门控钙通道（VGCC）而言，已在Lambert–Eaton综合征和副肿瘤自身免疫中检测到针对P/Q型或N型VGCC的抗体，但几乎没有证据表明该抗体与自身免疫性脑炎有关，与VGCC调节亚单位相关的自身免疫抗体尚未被研究。最近一种针对突触前VGCC辅助亚单位的新抗体——抗CaVα2δ抗体已被报道与自身免疫性脑炎相关。

在4735名接受自身免疫性脑炎抗体检测的患者的筛查样本中，62名患者的样本存在未知抗体（对大鼠脑切片的免疫组化反应阳性，无已知常规抗体）。通过对患者样本的血清和脑脊液评估后诊断排除非神经系统疾病的样本最终获得2例存在未知抗体阳性的患者样本。（1例病人同时患有其他疾病，在治疗途中死亡。）

患者1：16岁女性，前期有患有脑膜炎，脑膜炎改善后出现记忆丧失、精神病、癫痫发作和心理改变。发烧和头痛持续1周，随后出现由双侧外展神经麻痹引起的复视（第10天）。第12天脑脊液显示：开放压力增加（26.5cmH2O）、细胞增多（70个细胞/mm3，淋巴细胞60%）、高蛋白水平（186mg/dl）。第12天MRI显示胼胝体脾脏病变伴扩散受限。静脉注射阿昔洛韦治疗7天，复视和头痛缓解，在此阶段的诊断为病毒性脑膜炎。第18天，记忆力下降、行为异常和精神症状。CSF压力为20cmH2O，细胞增多（120个细胞/mm3，淋巴细胞92%），蛋白质水平高（138mg/dl）。第20天出现复发性非惊厥性癫痫发作并伴有口面部自动症，脑部MRI正常。静脉注射治疗，免疫球蛋白（第 21-25 天）和类固醇（第 20-24 天），精神状态恶化，神志不清，无言语输出，前庭眼反射、脑神经功能、肢体力量、感觉测试和反射均正常。第24天CSF显示开放压力正常 (13cmH2O)，细胞增多减少 (13 个细胞/mm 3)，蛋白质水平提高 (48mg/dl)，葡萄糖浓度正常。脑脊液病毒PCR和广泛的常规自身免疫抗体测试为阴性，血清和CSF中检测到抗CaVα2δ抗体。免疫治疗后，4个月内缓慢而完全地改善，没有剩余的神经功能障碍。

来自这2名患者（患者1和患者2）的血清和脑脊液样本在大鼠脑切片存在明显的突触免疫组化阳性信号（图1），显示海马层、基底节和皮质中的神经毡样染色。当与原代培养的大鼠神经元反应时，患者血清与细胞体、轴突和树突结合。免疫印迹法将患者样本与培养神经元的蛋白质反应，未发现可见的免疫反应带。

图1：脑脊液免疫组化反应。A-F来自2名患者（患者 1 = C、D；患者2=E、F）的CSF样本染色大鼠脑切片，结合到海马层、基底神经节和皮质，而对照CSF未染色（A、B）。图B、D、F是从图A、C、E 中的插图放大的视图。

通过免疫共沉淀实验获得该患者的神经元免疫沉淀物，将该沉淀物进LC–MS/MS分析：结果包括CaVα2δ蛋白作为可能的抗原靶点。因此，通过转基因技术稳定过度表达CaVα2δ蛋白的HEK 293T细胞，运用基因编辑技术获得了低表达CaVα2δ蛋白的HEK 293T细胞株系。为了排除可能的非特异性背景染色并确认真实的免疫反应性，我们将CaVα2δ过度表达的HEK 293T细胞与对照HEK 293T细胞以50:50的比例混合，并对混合细胞进行染色。正如预期的那样，抗CAVα2δ1商业抗体识别了一半的混合细胞，而对照CSF（cCSF）未染色任何细胞。

图2（G、H）患者样本还染色了原代培养的大鼠神经元的神经元树突；G组中的对照血清和H组中的患者血清。(I)基于 293T 细胞生CaVα2δ过表达的293T细胞，并使用针对 CaVα2δ1 的商业抗体通过蛋白质印迹法证实。(J)商业抗体染色CaVα2δ过表达细胞。(K)对照血清未显示细胞免疫染色。(L,-M)患者1和患者2的血清样本对细胞免疫染色呈阳性。(J-M) CaVα2δ 过表达细胞和正常293T细胞以50:50的比例混合，以排除假阳性背景染色。

患者抗体对CaVα2δ的特异性：通过患者血清和抗CaVα2δ商业抗体对培养的海马神经元进行双重染色，显示整个胞体和轴突共定位（图3A）。此外，使用带有AAV的靶向CACNA2D1的shRNA敲除CaVα2δ表达，关闭了患者血清对培养神经元的免疫反应性（见图3B，C），证实患者自身抗体对CaVα2δ具有特异性。两名患者自身抗体的主要免疫球蛋白G（IgG）亚型均为IgG2（图3D）。

图3 CaVα2δ及其IgG亚型患者抗体的特异性。A通过患者抗体（血清）和商用抗CaVα2δ抗体对原代海马神经元进行双重染色，证实抗体结合在整个胞体和轴突中的共定位。B、C使用带有AAV的靶向CACNA2D1的shRNA敲除CaVα2δ表达，关闭患者血清对培养神经元的免疫反应性，确认患者样本仅含有抗CaVα2δ抗体。C基因敲除组中eGFP阳性转染细胞对患者血清无免疫反应。D两名患者的主要亚型均为IgG2。（在过度表达CaVα2δ的293T细胞中检测；绿色=IgG FITC，蓝色=DAPI）

在剩余的60个抗体未知的样本中，使用开发的基于细胞的分析筛选抗CaVα2δ抗体，未发现其他具有抗CaVα2δ抗体的病例。我们还筛选了来自其他脑炎病例的82份样本（24份NMDAR脑炎、6份LGI脑炎、1份GABA-B脑炎和15份病毒性脑炎）和来自其他神经系统疾病的36份样本，未发现其他阳性病例。这些数据表明，抗CaVα2δ抗体在其他疾病中并不常见。

VGCC在神经系统中具有多种生理作用，控制神经元兴奋性和神经递质释放。VGCC由α1亚基和辅助α2δ和β亚基组成。当它们共同表达时，辅助亚单位促进Cav1和Cav2通道的α1亚单位运输到表面膜并调节其生物物理性质。CaVα2δ在天然神经元中的作用目前尚不完全清楚。该抗体是否对全身器官有任何影响尚不清楚。目前，我们知道CaVα2δ脑炎会诱发自身免疫性脑炎，伴有癫痫发作、记忆力减退、精神病和心态改变。如果发现更多病例，就有可能确定抗体的可区分表型。

参考文献：

1.CaVα2δ Autoimmune Encephalitis: A Novel Antibody and its Characteristics[J]. Annals of Neurology, 2021.