易操作、好推广！以智能手机为平台的荧光免疫层析定量检测装置
荧光免疫层析定量分析具有精度高、检测速度快、操作简单等优点，广泛应用于环境保护、食品安全、临床医疗等领域。
福州大学物理与信息工程学院、福州大学至诚学院、福州大学福建省医疗器械和医药技术重点实验室，福州的研究人员郑齐、吴辉煌、高跃明，在2020年第4期《电气技术》杂志上撰文，基于Android平台、OpenCV计算机视觉库的图像降噪等处理技术，开发便捷操作的人机交互应用程序；制作便于携带且与手机匹配良好的荧光试条图像采集暗盒；设计滑动窗口图像分割算法，提取试条测试线、质控线和背景区域的灰度值，最终计算出试条的特征值。使用标准试条图片，对装置检验结果的重复性、有效性、计算耗时等进行测试。
实验结果表明：检测装置准确定位荧光试条图像中的测试线和质控线；在试条有效测试范围内，测试线的灰度值降低时，荧光试条图像特征值随之单调递减；改变滑动窗口的宽度对特征值的影响微小。
近年来，现场快速检验（point of care test, POCT）已成为热门研究领域。POCT检测仪器操作简单、体积小巧、便于携带，广泛应用于临床疾病诊断。荧光免疫层析分析是利用荧光物质标记抗体后，结合免疫层析试纸上的抗原抗体的特异性反应，通过检测荧光强度进行定量分析的技术。
近年来，生物技术发展迅速，荧光免疫层析分析技术也从专业医疗场所检测，发展到基层社区检测。因此，设计一款人机交互友好、价格低廉、方便携带的荧光免疫层析定量检测装置具有重要的研究意义。
1 研究现状
荧光免疫定量分析方法可以分为光电扫描法和图像分析法等。光电扫描法采用步进电动机带动光电接收器件扫描荧光试条，通过分析光电接收器件输出的模拟电信号变化规律进行定量检测。目前常见的荧光免疫定量分析仪大多以光电扫描方法来实现，如：Lateral Flow（德国Qiagen公司）、i-CHROMATM Reader（韩国）、飞测Ⅲ（广州万孚）等免疫荧光分析仪。虽然这些仪器具有较高的精度和稳定性，但因体积较大、使用和维护成本较高，难以在基层和家庭普及使用。
图像分析法通过电荷耦合器件（charge coupled device, CCD）或者互补金属氧化物半导体（com- plementary metal-oxide-semiconductor, CMOS）传感器采集试条图像，并采用图像分割、处理等技术提取特征值。由于减少了扫描电机和模拟信号处理电路，且软件可在线升级，后期校准操作简单，因此与光电法相比较，图像分析法的检测装置结构简单、检测信息更加丰富，是实现便携式免疫层析试条装置的最有效手段。
本文利用现有智能手机作为终端设备，设计出具有激发光源的测试暗盒，形成一款易于操作、便于推广的荧光免疫层析定量检测装置。
2 荧光免疫定量检测装置设计
本文设计的荧光免疫定量检测装置，主要由Android智能手机和荧光测试暗盒构成，如图1所示。制作时，选用魅蓝E智能手机作为载体，通过编写手机App实现人机交互功能，调用手机的主摄像头采集荧光试条图像，借助手机的运算核心进行图像分析。3D打印荧光暗盒由上下两个部分组成，上半部分设计手机固定结构，并装配LED、微距镜、滤镜、电池等器件；下半部分包括荧光试条固定卡槽、装配定位销等结构。荧光测试暗盒结构如图2所示。
图1 荧光免疫层析试条检测装置结构示意图
图2 荧光免疫层析试条检测装置暗盒结构图
为了提高试条图像数据的一致性，系统应消除外界光线的干扰，整个光路尽可能空间密闭[11]。采集图像时所需要的照明光线，由340nm波长的激发光源提供。取景口加装微距镜，将暗盒高度从7cm缩小到3.5cm；微距镜前添加中心波长610nm的滤光镜，减小其他波长的光线对荧光的影响；荧光暗盒内部部分区域贴上漫反射片，延长光路并增大LED照射范围。
2.1 Android软件设计
本文设计的检测装置软件，基于Android Studio平台开发，同时借助OpenCV计算机视觉库、LitePal开源Android数据库进行图像分析及数据处理。以高精度、高效率、友好的人机交互体验为目标，提高不同Android版本、终端设备间的兼容性，为后期的大面积推广应用做准备。
软件流程如图3所示，图中图像处理环节：调用截图函数对试条图像进行剪切，以获得试条观察窗部分的图像；再使用OpenCV计算机视觉库的降噪函数进行图像降噪处理。
人机交互流程如图4所示，整个程序以主页面为中心枢纽，首页可跳转至历史记录显示页面，方便用户查询数据，同时也支持触发程序主页面。主页面内包含程序的主要功能，按需跳转至不同的功能页面。为支持对前期采集的试条图像进行计算，采集按钮设计成触发相册页面。采集新图像时，点击相册内置的拍照按钮，程序转至拍照页面。
图3 荧光免疫层析试条检测软件流程图
图4 人机交互流程
2.2 T线、C线图像分割及特征值提取
对试条图像进行观察、比较过程中，发现试条做工比较精细；质控线（control line, C线）、测试线（test line, T线）垂直方向上荧光物质分布均匀，形状为矩形；不同批次的试纸条T线、C线位置基本一致；试条观察窗背景颜色单一，与目标图形差异主要体现在灰度值上。荧光暗盒上设计的试条、手机固定装置，结实牢靠且匹配精度高。
基于软件图像处理、分析的灵活性考虑，本文采用固定窗口预截图后，计算、比较滑动窗口覆盖区域的灰度值，实现T线、C线的图像探测与分割。该方法既有效地提取图像中的目标区域，又节约系统的运算资源，提高软件运行速度。
滑动窗口运动方式如图5所示，黑色矩形代表左边滑动窗口，灰色矩形代表右边滑动窗口，以横坐标X中点为界把图像分为左右两个部分，两个滑动窗口在各自的区域内，以一个像素点为步长水平移动。每移动一次，计算出当前覆盖像素的灰度值总和，经过比较算出左右区域的最大值。
在双抗夹心荧光免疫层析试条定量分析时，可用T线、C线像素灰度值的比值作为特征值。荧光标记物在层析的过程中，少量残留于试条背景区域上，在设定特征值时应考虑背景区域的影响。令左边滑动窗口当前覆盖区域的灰度值总和为Hx，最大值为HC；右边滑动窗口当前覆盖区域的灰度值总和为Hy，最大值为HT；特征值
公式（1）
图5 滑动窗口运动方式
2.3 标准试条图像测试
为了验证软件设计的图像分割、特征值提取算法，本文使用标准荧光试条图片，对检测装置进行测试。
图6 荧光试条标准图像
由于软件算法设计合理，实际计算过程中耗时少。图7列出1号至12号试条识别的结果，左边的矩形框内为C线，右边矩形框内为T线。
图7 试条T线、C线检测及分割结果
由图7可知，软件在标准试条图像测试中，准确识别出各试条的T线和C线。当试条上的荧光物质较多时，摄像头采集到的测试线、质控线图像出现光晕。实测试条T线和C线宽度约为60个像素点，滑动窗口宽度越接近T线、C线的实际宽度时，计算结果越准确。
但是滑动窗口越宽，数据量越大，增加软件计算时间。假设T线、C线荧光物质横向富集特性相似，通过适当缩小滑动窗口宽度，提高软件计算效率。本文滑动窗口宽度取10～70像素点，每次递增10点进行实验，特征值t的测试结果见表1。
表1 不同宽度滑动窗口计算标准试条特征值结果
表1中数据显示，随着滑动窗口宽度逐渐增大，同一试条的特征值呈缓慢减小趋势。
由图8得出，软件计算出来的试条图像特征值，随图像T线的灰度值降低而单调递减；同时取滑动窗口宽度50像素点计算结果比较发现，特征值整体变化趋势一致，线性拟合时R2＞0.96。说明滑动窗口分割法在标准试条图像分析、计算中，有效提取图像的特征值。
图8 特征值t分布图
在测试过程中，二次安装试条时，T线、C线可能发生位移。另外由于试条卡槽横截面梯形设计，试条前、后、上、下可移动的范围非常小。现把试条分别左、右移动25像素点、50像素点，上、下移动5像素点进行模拟测试，结果见表2。
由表2可知，试条左、右移动时，除了12号试条右移50像素点时，特征值增大0.001，其他试条计算结果保持不变；试条上、下移动时，特征值变化在0～0.002范围内，不影响检测装置定量分析。
表2 左右移动试条特征值计算结果
程序响应时间也是检测装置性能的一项重要指标，表3列出试条计算时间，结果显示计算耗时分布比较随机，大致落在260～310ms区间内，程序算法效率较高。
表3 计算标准试条特征值耗时
3 结论
本文设计了基于Android平台的荧光免疫层析试条检测装置，编写了Android智能手机定量分析App，提出了滑动窗口图像分割算法。实验结果显示，系统准确定位试条T线和C线，特征值随荧光强度降低单调递减，试条T线和C线荧光物质纵向上分布、横向分布趋势一致，缩小滑动窗口宽度对特征值计算结果影响微小。本文研制的检测装置经校准后，适用于荧光免疫层析试条定量分析。
由于受实验条件、制作工艺、软硬件开发水平等因素影响，该检测装置研制完成后，还存在一些不足之处，有待日后进一步完善：
1）用真实试条对检测装置进行校准。
2）兼容多种荧光免疫层析试条。各试条厂商生产的荧光免疫层析试条尺寸大小不一，本文设计的试条卡槽的尺寸参数固定，后期可增加弹片、偏心螺母等调节机构设计，对不同尺寸的试条进行匹配。