荧光定量PCR检测miRNA中遇到的常见问题

一、反转录引物(RT引物)设计

　　实时荧光定量PCR检测miRNA的难点在于如何识别只有22nt左右的miRNA并合成第一链，目前常用的方法主要有茎环法和加尾法。

　　茎环法：引物由可以自身呈茎环状的特异序列+6~8个miRNA3’端反向互补碱基组成。该RT引物可以与成熟miRNA结合，形成反转录引物/成熟miRNA复合物，并在miRNA的5’末端延伸，这样就得到一个较长的反转录扩增子，为后续的荧光定量PCR提供了符合要求的模板。原理示意图如下：

　　加尾法(Oligod(T)特异RT引物法)：RNA在反转录前需要进行末端Poly(A)加尾，所有miRNA可以公用一个Oligod(T)的引物(由特异序列+(T)20左右+兼并碱基V或VN组成)。加尾法特异性稍低，但设计及操作简单。原理示意图如下：

　　二、荧光定量PCR引物探针设计

　　反转录后得到的cDNA为复合片段(miRNA+引物)，上游引物为特异性引物，在miRNA上设计，若GC含量太低，可以在上游引物5’端加入GCGC等保护碱基，下游引物为通用引物，与RT引物的某一段相匹配。

　　荧光定量PCR检测方法主要有SYBR Green染料法和TaqMan探针法。前者需调整引物浓度，提高引物扩增效率，尽量减少引物二聚体与非特异性扩增;探针法需设计荧光探针，探针设计位置可以有3种：完全与miRNA序列相同、在miRNA与RT引物的交叉位置、完全在RT引物上。至于探针要设计在哪个位置，可根据自己的实验情况来定。