植物再生和防御开关 转录因子WIND还控制道管重塑和自然免疫-

2021年8月20日

物理化学研究所

东京大学研究生院理学系研究科

神户大学

新潟大学

帝京大学

京都尖端科学大学

植物再生和防御开关 转录因子WIND还控制道管重塑和自然免疫-

由理化学研究所(理研)环境资源科学研究中心细胞功能研究小组的岩濑哲高级研究员、杉本庆子小组组长(东京大学研究生院理学系研究科教授)、植物免疫研究小组的阿努·拉奥·哈比实研究员、白须贤小组组长(东京大学研究生院理学系研究科教授)、神户大学理学研究科的近藤余贵副教授 、新泻大学理学系的池内桃子副教授、帝京大学理工学部的朝比奈雅志副教授、京都尖端科学大学生物环境学部的福田裕穗教授等组成的联合研究小组发现，转录因子[1]WIND不仅对伤口的愈伤组织化[2]，而且对道管[3]的再形成和病原菌的抗药性也起着重要的作用。

本研究成果有望为利用组织培养技术增产、品种改良、嫁接[4]的效率化、病害抗性赋予等，为植物持续生产食物生物量做出贡献的技术开发。 植物如果受伤的话，会产生组织的再生和防御响应等各种各样的生理反应，但是综合地激活这些反应的分子的存在还不知道。 研究表明，转录因子WIND1之一可以促进伤害应激引起的愈伤组织[2]的形成和茎叶的再生。 这次，联合研究小组利用拟南芥[5]，全面调查了通过WIND1增加表达量的基因。 结果表明，不仅与再生相关的基因，与道管的形成和防御应答相关的基因的表达也会上升。 另外，如果抑制WIND1和其他WIND(WIND2~4)的功能，嫁接对道管的再形成和病原菌的抵抗性就会减弱，由此表明WIND实际上是综合控制伤口修复和防御响应的因子。

本研究刊登在了科学杂志《New Phytologist》的在线版( 8月10日)上。

转录因子WIND1不仅控制愈伤组织的形成，还控制道管重塑和防御响应

背景

我们的身体在受伤后，在堵塞伤口寻求治愈的同时，也会产生抑制病原菌入侵和繁殖的免疫应答。 植物也一样，在伤口处可以激活组织再生和防御应答等多种生理反应，但综合控制这些反应的分子的存在还不知道。 高级研究员岩瀬哲等人对植物响应各种压力引起组织再生的分子机制进行了分析，并介绍了2011年通过拟南芥发现了促进伤口细胞脱分化的“转录因子wind1( wound induced dedifferentiation1)”和具有相同功能的WIND2~4注1 )。 另外，在分化的细胞中，有将WIND的作用抑制为表观遗传学[7]的机制，明确了WIND通过伤口活化ESR1这一其他转录因子的作用，促进伤口处愈伤组织的形成和茎叶的再生，注3 )。 此次，联合研究小组全面调查了由转录因子WIND表达的基因，解析了伤口再生相关因子的搜索和WIND迄今为止不为人知的功能。

注1 ) 2011年3月11日新闻发布会“发现促进植物细胞脱分化的开关因子”

注2 ) 2015年6月30日新闻发布会“阐明抑制植物分化全能性的分子机制的一部分”

注3 ) 2017年1月17日新闻发布会“植物在伤口处再生茎叶的结构”

研究方法和成果

联合研究小组首先通过向培养基中添加一种叫做雌二醇的化合物，制备了能够表达和诱导WIND1基因的拟南芥植物体( XVE-WIND1)。 用DNA微阵列法[8]研究了10日龄无损伤萌发诱导WIND1基因后经过0、1、3、6、12、24小时时的基因表达，表明约2,400个基因在诱导后24小时内表达(图1 )。

这些基因根据表达模式被分为四组。 在初期显示暂时性表达的小组(表达诱导后1~3小时表达量上升，6小时后恢复原状)中，含有很多与病害响应相关的基因。 显示恒常表达的组(表达诱导后1~3小时表达量上升，到24小时后维持高表达量)中含有大量各种转录因子的基因，暗示了WIND1作为转录网络的重要调控因子发挥着作用。 在这个恒定表达组，以及在较晚的时间(表达诱导后12小时或24小时)表达的组中，含有很多与伤害应答相关的基因、对水分缺乏做出响应的基因、与细胞壁建模相关的基因等。

图1在拟南芥中由转录因子WIND1表达的基因的分组

在可通过添加雌二醇诱导WIND1基因表达的植物体( XVE-WIND1)中，约2,400个基因在24小时内表达。 在图中，将这些基因排列在纵轴上，横轴表示了随着时间推移基因表达的变化量。 红色表示表达量上升，黄色表示无变化，绿色表示下降。 根据虚线表达的模式分为四组。 在野生株( WT )中，表达量几乎没有发生变化。

细胞功能研究小组此前通过文献调查列出了91个细胞重编程(初始化)相关基因，其中30个基因是在WIND1基因表达诱导后24小时内表达的。 其中含有ESR1基因，另外还含有LBD18、OBP4、ESR2、RAP2.6L、ERF115、WUS、PLT5、WOX5、LEC2、ANAC071等重要转录因子的基因。

因此，制备了这些因子的功能抑制植物体或功能缺失突变体，观察了伤害处理后的愈伤组织形成。 另外，用WIND1的功能抑制植物体( WIND1-SRDX[9] )以各因子的基因表达量为指标进行了调查，结果在叶柄(连接叶和茎的部位)的伤口处，RAP2.6L和ERF115作为WIND(WIND1~4)的下游因子促进了愈伤组织的形成(图2 )。 研究表明，这两个转录因子的基因也与WIND和ESR1一样，包含在AP2/ERF型转录因子[10]的组中，它们通过分级调控关系促进愈伤组织的形成。

图2 WIND1调控的转录因子的功能抑制缺失株上伤口的愈伤组织形成抑制

在拟南芥叶柄切断部位形成的愈伤组织的照片。 黄色的部分是愈伤组织。 转录因子WIND1的功能抑制植物体( WIND1-SRDX )、转录因子RAP2.6L和ERF115的功能缺失突变体( rap2.6l-1和ERF115 )和功能抑制植物体( RAP2.6L-SRDX和ERF115-SRDX )的愈伤组织 标尺为1毫米。

其次，作为至今尚不为人知的WIND功能，着眼于道管的再形成。 迄今为止，有报道称，在愈伤组织细胞块中形成了构成道管的管状要素(细胞壁上沉积有木质素[11]的死亡细胞)，以及伤害应激导致伤口细胞分化转换为管状要素[12]的现象。 这次，在诱导WIND1基因时表达上升的细胞壁相关基因中也发现了促进管状要素形成的转录因子基因，由此提出了“在伤口和愈伤组织中WIND参与道管的再形成”的假说。

详细观察后发现，在过度表达WIND1基因的植物体中，子叶的叶肉细胞和根尖的根毛细胞等分化转换为管状要素。 这是表明WIND1的功能之一包括管状元素形成的重要数据。 为此，采用visual ( vascular cell induction culture system using Arabidopsis leaves )法[13]，在4天左右的液体培养条件下，人为诱导叶肉细胞分化转化为含有管状要素的维管束[3]细胞，结果抑制了WIND1功能抑制植物体( WIND1-SRDX )和WIND1~4的基因功能全部被破坏的wind1/2/3/4四重突变体中异位管状要素的形成受到抑制(图3 )。 另外，还发现，从VISUAL法培养开始的48小时内，WIND1-SRDX植物体中与道管形成相关的基因( VND7和LBD15等)的表达上升受到抑制。

图3转录因子WIND的功能抑制缺失株中管状要素的形成抑制

左) 采用VISUAL法，将WT和WIND1功能抑制植物体( WIND1-SRDX )子叶的叶肉细胞分化转化为维管束细胞。 绿色或黄色表示管状要素。 可见，WIND1-SRDX几乎不能产生异位管状要素，只有原有维管束的管状要素(道管)被染成黄色，与WT相比管状要素较少。 标尺为0.5毫米。 右)通过子叶整体面积中荧光面积的比例估算的向管状要素的分化率的图表。 发现在WIND1-SRDX和功能缺损突变体( wind1/2/3/4)中，管状要素的形成受到抑制。

因此，用这些WIND功能抑制植物体对组织的再粘接和道管的再形成进行了评价。 作为实验方法，先用叶柄部分切断叶片，再次在同一部位连接，进行叶柄的嫁接(嫁接)，使根部吸收含有荧光色素的水，确认叶片(叶片)维管束中的荧光后，拉伸叶片。 结果表明，WIND1-SRDX植物体和wind1/2/3/4四重突变体中，道管再形成受到明显阻碍(图4左)。 在仅缺失WIND1基因功能的WIND1突变体中也观察到了该抑制，由此表明WIND1的功能对于叶柄接枝叶面上可见的道管再形成很重要。 另外，在WIND1-SRDX植物体中，组织的再粘接也受到阻碍，因此提示了切断面上形成的愈伤组织的质量(大小、细胞壁的质量等)会影响组织的再粘接(图4右)。

图4转录因子WIND对功能抑制缺失株中道管重组的抑制

采用叶柄嫁接(接叶)法，评价了WIND的组织再粘接能力(左)和道管再结合能力(右)。 在功能抑制植物体( WIND1-SRDX )中，组织复合率和道管复合率都很低，在功能缺损突变体( wind1、wind1/2/3/4)中，道管复合率很低。 这表明，组织再粘接中除了WIND以外，还存在许多功能重复的因素，并且在组织粘接面的道管再结合方面，WIND的贡献度更高。

最后，调查了WIND与病害响应的关系。 为了调查植物的病害响应机制，经常使用感染拟南芥并引起斑点病的细菌PSeudomonas Syringae PV.tomato DC 3000株[14]。 对在感染了这种细菌的拟南芥中表达的基因进行了调查的先行研究的基因列表，和通过这次调查的WIND1基因诱导的基因列表在统计上明显重复。 于是，分别将P. syringae感染到野生株、WIND1-SRDX植物体、wind1/2/3/4四重突变体中。 于是，在WIND1-SRDX植物体和wind1/2/3/4四重突变体中，发现了P. syringae比野生株高的增殖(图5 )。 这表明WIND转录因子具有抑制P. syringae增殖的作用。

图5转录因子WIND的功能抑制缺失株对病原菌敏感性的上升

对带有拟南芥野生株( WT )、WIND1-SRDX突变体、wind1突变体、wind1/2/3/4四重突变体*的叶片注入等量病原菌后3天，用菌落计数法计数增殖的菌体数(左)。 结果表明，WIND1-SRDX突变体和wind1/2/3/4四重突变体与野生株相比，细菌更容易统计增殖，即抗性较弱(右)。 标尺是2厘米。

已经有报告称，功能缺失会导致P. syringae的感染性上升，除此之外，还调查了WIND1基因的表达诱导中表达水平增加的几个重要基因在伤害后的表达。 结果表明，野生株在伤害后的叶柄部位，与抗菌性次生代谢产物卡马霉素[15]的合成相关的CYP71A13基因、与诱发病害抗性的化合物哌啶酸[16]的合成相关的ALD1基因等的表达上升，相反，在WIND1-SRDX植物体和wind1/2/3/4四重突变体中，其表达受到抑制(图6 )。

图6 WIND的功能抑制缺失株中防御应答相关基因的伤害引起的表达上升的抑制

切断拟南芥叶柄部位，将叶片在不含植物激素的培养基中培养，用RT-qPCR法分析0、1、3、6、12小时后切断部位CYP71A13基因(左)和ALD1基因(右)的表达。 在野生株( WT )中，两个基因的表达都有所上升。 另一方面，发现在WIND1-SRDX植物体和wind1/2/3/4四重突变体中，存在着与野生株( WT )相比表达受到明显抑制的多个时间点。

今后的期待

本研究发现，转录因子WIND1和其他WIND(WIND2~4)是能够综合控制伤口愈伤组织、组织再粘接、道管再结合等组织再生机制和对细菌等防御响应的分子。 由于伤害压力伴随着病原体从伤口感染的风险，因此同时提高再生和免疫反应在生理学上是合理的。 例如，已知哺乳类也存在对伤害反应而表达上升、创伤部位再生、血管新生、体液免疫的活性化等具有广泛功能的转录因子。 认为具有像WIND那样能够快速诱导多条路径的因子，在进化过程中有利于植物的生存。 今后，伤口的防御活性物质的合成是否与WIND实际相关，以及如何诱导多样的基因等分子机制的阐明也将继续下去。 通过对油菜籽等实用作物的研究也同时进行，有望实现利用组织培养技术的增产和品种改良、嫁接的效率化和病害抗性赋予等，为植物持续生产食物生物量做出贡献的技术开发。 另外，本研究成果为联合国2016年制定的17个“可持续发展目标( SDGs ) [17]”中的“2 .杜绝饥饿”和“15 .保护陆地富裕”做出了巨大的贡献。

补充说明

1 .转录因子 一组与特定的DNA序列结合，调控基因表达的蛋白质。 比如基因表达的开关，促进基因表达的叫做转录激活因子，抑制基因表达的叫做转录抑制因子。

2 .愈伤组织化、愈伤组织

愈伤组织是原表示植物在伤害部位形成的细胞块的语言，也称为愈伤组织。 现在，它被广泛用作表示组织培养条件下由组织切片产生的细胞团的词语。 愈伤组织的产生称为愈伤组织化。 在医学领域，骨折后产生的小骨头碎片、皮肤上形成的坚硬组织、胳膊也被称为愈伤组织。

3 .道管、维管束

植物具有运输水和光合作用制造的糖等营养的通道组织。 用于输送水和无机养分的管是道管，用于输送营养的管是筛管。 维管束是指许多道管和筛管等聚集成束的部分。

4 .嫁接

是将植物体在切断面上粘接的方法，无论是农业还是植物的基础科学都自古以来被使用。 例如，以具有耐病害虫根的近缘种为砧木，以好果实的品种为穗木相接，可以培育出耐病害虫的好果实个体。 在发生嫁接的断面上愈伤组织的形成很频繁，已知愈伤组织的质量会影响嫁接的好坏。 在嫁接面上，砧木和穗木的组织之间发生了道管和筛管的再结合。

5 .拟南芥属

十字花科植物。 2000年全基因组序列被解读，为了调查植物具有的环境响应功能和各个基因功能，在世界范围内被用于研究材料。

6 .免疫

是对侵入体内的异物和病原菌进行抵抗、排除、消灭的能力，先天具备的免疫称为自然免疫，后天具备并记忆的免疫称为获得免疫。 已知植物具有自然免疫，感染细胞将病菌卷入而死亡，或者活化用于防御的低分子化合物和蛋白质的生产。

7 .表观遗传学

近年来，人们发现，通过DNA的甲基化和DNA缠绕的组蛋白的化学修饰(甲基化和乙酰化等)，基因表达的难易程度发生变化，并且其状态会在细胞分裂后的女儿细胞和某些情况下传承给下一代。 这种研究不依赖于基因主体DNA碱基( a、t、g、c )排列方式的变化而发生的基因表达的控制和传递的研究领域被称为表观遗传学( epi-后生的genetics-遗传学)。 表观遗传学是具有形容词用法的词语，专门表示DNA甲基化和组蛋白修饰所支配的基因表达的变化状态。

8. DNA微阵列法

网罗性基因表达分析法之一。 事先选择某生物所具有的全部基因和想调查的基因，以其实体DNA为基础进行固定(微阵列)。 在这里，以从任意状态的生物体中取出的mRNA为模板，通过逆转录转换为cDNA后，安装发出荧光的分子。 通过使这种荧光标记的cDNA与微阵列发生反应并读取荧光强度，可以定量且全面地调查所关注的基因的表达量。

9. SRDX

由平津圭一郎博士等人于2002年报告。 在转录抑制因子SUPERMAN蛋白质中发现的短氨基酸序列域( LDLDLELRLGFA )，通过将其赋予转录活性因子的氨基酸序列，可以转换为强转录抑制因子(嵌合抑制子)。 表达了嵌合抑制子的植物显示出显性·消极的表现型。 这被认为是由于嵌合抑制子优先于功能重复的其他转录因子而抑制靶基因的表达，最近有报道称该结构域与组蛋白化学修饰相关调控因子结合。 超级复制域x的缩写。

10. AP2/ERF型的转录因子

转录因子在其蛋白质结构中具有与DNA结合的氨基酸序列区域(结构域)，通常该区域的氨基酸序列的进化保存性较高，因此可以按结构域进行分类。 按领域特征总结的因子群有时伴随着“类型”和“家族”的词语作为整体表现出来。 AP2和ERF分别是单独的转录因子的名称，具有与这些因子相似结构域的转录因子表示为AP2/ERF型和AP2/ERF家族。 有被真核生物普遍保存的区域，也有被该物种特异性保存的区域。 AP2/ERF型被认为是植物特异性转录因子群。

11 .木质素

植物中含有的高分子化合物，是由被称为一元醇的酚性化合物聚合而成的。 分布在以细胞的二次壁和道管为首的根的凯氏带、花药壁的内被细胞、鞘的开裂部等，由于疏水性和结构的硬度，在通水和开裂机构中发挥作用。

12 .分化转换

广义上的意思是指一旦分化了，具有功能的细胞就会变化成其他的分化状态。 维管束干细胞标记基因的表达表明，拟南芥VISUAL法中叶肉细胞分化为管状要素时，曾一度脱分化为具有干细胞性质的细胞。 狭义上也可以用作表示不经过干细胞化而直接转换( Transdifferentiation )的词。

13 .可视化( visual )法

由联合研究小组的近藤余贵博士、福田裕穗博士等人于2016年开发的方法，利用拟南芥萌发的子叶等，将一度分化的细胞(例如叶肉细胞)脱分化为具有维管束干细胞性的细胞后，再分化为道管和筛管等构成维管束的细胞，从而实现了分化。 由于培养开始仅4天左右就发生细胞分化转换，且细胞同步性高，近年来被频繁用于维管束细胞形成的机制解析。

14. Pseudomonas Syringae PV.Tomato DC 3000股

假单胞菌是一种细菌，被归类为革兰氏阴性杆菌。 栖息在植物的叶子表面等，从气孔和组织的伤口侵入，发挥病原性。 tomato DC3000株以西红柿和拟南芥属的植物为宿主。

15 .卡马来星

拟南芥产生的次生代谢产物之一(被归类为含硫吲哚生物碱)，是对病原体感染的化学防御物质。 被认为是由氨基酸的一种色氨酸通过7次酶反应合成的，CYP71A13是掌管二甲苯前体吲哚-3-乙醛肟的吲哚乙腈反应的酶。

16 .哌啶酸

一种由氨基酸赖氨酸生物合成的羧酸。 近年来研究表明，植物通过病害响应促进生物合成，哌啶酸产生的N-羟基哌啶酸是引起全身性获得抗性的重要信号因子。 已知哌啶酸生物合成的重要酶ALD1，如果其功能缺失，病害抗性会减弱。

17 .可持续发展目标( SDGs )

2015年9月联合国峰会通过的《可持续发展2030议程》中列出的2016年至2030年国际目标。 它由实现可持续发展世界的17个目标组成，发誓不会被地球上的任何一个人所淘汰。 SDGs不仅是发展中国家，也是发达国家自身致力的环球(普遍性)的东西，日本也在积极地进行着。

联合研究小组

理化研究所环境资源科学研究中心

细胞功能研究小组

高级研究员岩濑哲 (科学技术振兴机构( JST )先驱研究员)

技术人员ⅱ竹林有理佳

队长杉本庆子(杉本庆子) (东京大学研究生院理学系研究科教授)

植物免疫研究小组

研究员阿努蓬·拉奥哈比希特( Anuphon Laohavisit )

集团总监白须贤 (东京大学研究生院理学系研究科教授)

神户大学研究生院理学研究科生物学专业 副教授近藤余贵

新潟大学理学系 准教授池内桃子

帝京大学理工学院生物科学系

研究员(研究当时)松冈启太(研究员)

准教授朝比奈雅志

产业技术综合研究所生物工艺研究部门植物功能控制研究组

小组长光田展隆

东京大学研究生院理学系研究科生物科学专业 教授( 2021年3月退官)福田裕穗(福田裕雄) (现京都尖端科学大学生物环境系教授)

研究支援

本研究由日本学术振兴会( JSPS )科学研究费补助金基础研究( c )“伤害诱导性脱分化的分子网络解析(研究代表者:岩濑哲)”、 新学术领域(研究领域建议型)“支撑植物生命力的多功能干细胞基础原理”的研究课题“非生物胁迫下维管束干细胞新生的分子机制(研究代表者:岩濑哲)”、“伤害胁迫诱导性愈伤组织的干细胞新生机制(研究代表者:岩濑哲)”、 该基础研究( b )“控制植物器官再生的分子机构(研究代表者:杉本庆子)”、学术变革领域研究( a )“支撑植物抵抗不均匀环境变化的多层信息管理的分子机构”的研究课题“支撑植物环境抵抗的伤害修复机构(研究代表者:杉本庆子)”

原论文信息

Akira Iwase, Yuki Kondo, Anuphon Laohavisit, Arika Takebayashi, Momoko Ikeuchi, Keita Matsuoka, Masashi Asahina, Nobutaka Mitsuda, Ken Shirasu, Hiroo Fukuda, Keiko Sugimoto, "WIND transcription factors orchestrate wound-induced callus formation, vascular reconnection and defense response in Arabidopsis", New Phytologist, 10.1111/nph.17594

发表者

物理化学研究所 环境科学研究中心细胞功能研究小组 高级研究员岩濑哲 队长杉本庆子(杉本庆子) (东京大学研究生院理学系研究科教授) 植物免疫研究小组 研究员阿努蓬·拉奥哈比希特( Anuphon Laohavisit ) 集团总监白须贤 (东京大学研究生院理学系研究科教授)

照片从左开始依次为杉本庆子、岩濑哲、阿努蓬·拉奥哈比希特、白须贤

神户大学研究生院理学研究科生物学专业 副教授近藤余贵

新潟大学理学系 准教授池内桃子

帝京大学理工学院生物科学系 准教授朝比奈雅志

京都尖端科学大学生物环境系 教授福田裕穗

新闻负责人

理化学研究所宣传室新闻负责人

呼叫表格在新标签中打开

东京大学研究生院理学系研究科宣传室

Email: kouhou.s [at] gs.mail.u-tokyo.ac.jp

神户大学总务部宣传科

Tel: [phone] / Fax: [phone]
Email: ppr-kouhoushitsu [at] office.kobe-u.ac.jp

新潟大学宣传室

Tel: [phone] / Fax: [phone]
Email: pr-office [at] adm.niigata-u.ac.jp

帝京大学本部宣传科

Tel: [phone] / Fax: [phone]
Email: kouhou [at] teikyo-u.ac.jp

京都尖端科学大学宣传科

Tel: [phone] / Fax: [phone]
Email: kouhou [at] kuas.ac.jp

※请将上述[at]替换为@。

产业利用咨询

呼叫表格在新标签中打开

注1(日文未译)

2011年3月11日

独立行政法人 理化学研究所
独立行政法人 産業技術総合研究所

植物細胞の脱分化を促進するスイッチ因子を発見

－組織培養の高効率化で、植物の増産や有用物質生産などの応用に期待－

· 英語ページ

ポイント

· WIND1は、植物の脱分化細胞（カルス）形成を促進する核内スイッチタンパク質

· WIND1遺伝子は、傷口で発現が増大し、植物ホルモンへの応答性を高める

· WIND1遺伝子のオン／オフで、カルスの誘導と根や茎葉への再分化が制御可能に

要旨

独立行政法人理化学研究所（野依良治理事長）と独立行政法人産業技術総合研究所（野間口有理事長）は、傷ストレスを受けた植物がカルス※1（脱分化※2した植物細胞の塊）を形成する際に働くスイッチタンパク質「WIND1」を明らかにしました。これは、理研植物科学研究センター（篠崎一雄センター長）細胞機能研究ユニットの杉本慶子ユニットリーダーと岩瀬哲基礎科学特別研究員、産総研生物プロセス研究部門（鎌形洋一研究部門長）遺伝子転写制御研究グループの高木優研究グループ長らを中心とした共同研究グループの成果です。

農業や園芸分野では、苗のクローン増殖として挿し木法が広く活用されているように、植物の高い器官再生能力は古くから知られています。これは、傷ストレスを受けた植物が傷口の細胞を脱分化させる能力、すなわち細胞の分化※2の度合いを下げて分裂を促進させ、新しく器官を作る準備をする能力に優れているためですが、この分子メカニズムは不明でした。

研究グループは、シロイヌナズナ※3の脱分化した細胞で発現が促進しているWIND1という転写因子※4の遺伝子を同定し、これをシロイヌナズナ植物体で過剰に発現させると、植物体の各器官でカルスが形成されることを発見しました。またWIND1遺伝子は、傷ストレスによって傷口で発現が増大し、植物ホルモン※5の1つであるサイトカイニン※5への応答を高める働きがあることを明らかにしました。またWIND1遺伝子の発現を人為的にオン／オフする実験では、WIND1遺伝子の発現をオンにして一度脱分化させた細胞でこの発現をオフにすると、茎葉や根がカルスから再生（再分化※2）してくる現象を見いだしました。さらに、転写因子WIND1の機能を抑えると傷口での脱分化が抑えられることから、WIND1が植物体の傷口で起こる脱分化を促進するスイッチ機能を有していることが分かりました。

今回の研究は、植物が傷ストレスに応じて脱分化を促進する、という古くから知られていた現象を分子レベルで明らかにした世界初の成果で、効率の良い組織培養※6による植物の増産や有用物質生産などの応用に貢献することが期待されます。

本研究成果は、米国の科学雑誌『Current Biology』3月22日号に掲載されるのに先立ち、オンライン版（3月10日付：日本時間3月11日）に掲載されます。

背景

体に傷ストレスを受けた多細胞生物では、新しく細胞を増殖させて素早く傷口をふさぎ、元通りの組織・器官や新しい別の組織・器官を再生するという現象がよく観察されます。新しい別の組織・器官を再生する時、傷口では、一度分化した体細胞がより低い分化状態になり、細胞分裂能と多分化能（細胞がさまざまな種類の細胞に分化できる能力）を再獲得する「脱分化」というプロセスを経ることが知られています。この細胞の脱分化現象は、植物や一部の動物でも古くから知られていましたが、どのようにして引き起こされるのか、その分子メカニズムは現在でも不明な点が多く、生命科学全体の大きな研究課題の1つとなっています。また細胞の脱分化は、再生医療の基盤となる生命現象であるため、iPS細胞に寄せられる社会的な期待が示すように、現在この分子機構の解明と応用の進展が、国内外で非常に高い注目を集めています。

特に植物は高い再生能力を有していることが古くから知られ、苗の増殖に挿し木法が用いられるなど、広く農業や園芸分野で利用されてきました。さらに、植物体から切り取った組織片の脱分化と再分化には、植物ホルモンであるオーキシン※5とサイトカイニンの濃度比が重要であることが20世紀半ばに明らかとなり、試験管内でのカルス培養法と根や茎葉などの器官への再分化法が確立されてきました。また、タバコの葉の1個の分化した細胞（葉肉細胞）からカルスを経て個体を再生させた歴史的研究から、植物細胞には分化全能性※7があることが明らかとなっています。こうして確立された植物細胞の脱分化・再分化を制御する方法は、新品種作製や有用物質生産などの応用科学に用いられ、種苗産業や花卉（き）・園芸産業などの基盤技術として広く活用されています。しかし、植物細胞の分化全能性そのもの、特に脱分化現象に対する分子レベルの理解は立ち後れていました。

研究グループは今回、植物の脱分化した細胞の遺伝子発現に着目し、この謎に挑みました。

研究手法と成果

（1）植物の脱分化細胞で発現が促進している遺伝子のスクリーニング

研究グループは先行研究として、モデル植物であるシロイヌナズナを用い、脱分化した細胞の中で発現が促進している遺伝子を探索しました。具体的には、植物体と3種類のカルス細胞株に対してDNAマイクロアレイ法による網羅的遺伝子発現解析を行い、分化した植物細胞に比べて3種類のカルス細胞株で共通に発現が促進している遺伝子を選抜しました。その中で、植物細胞でのストレス応答や形態形成に関わる因子が含まれることがよく知られているAP2/ERF転写因子ファミリーに属するRAP2.4遺伝子に注目しました。RAP2.4という名前は、その分子の機能を反映する名前ではなかったため、今回の研究成果に基づいて、この転写因子の遺伝子をWound INduced Dedifferentiation (WIND) 1と名付けました（図1）。

（2）WIND1遺伝子の発現は傷ストレスによって傷口で強く誘導される

遺伝子の発現レベルの変化量を測定するリアルタイム定量PCR法と、遺伝子のプロモーターレポーター解析※8を用いて、WIND1遺伝子が植物体でどのような時に強く発現するかを観察する実験を行いました。その結果、分化した植物体の組織に傷をつけると、数時間でWIND1遺伝子の発現が促進し、WIND1遺伝子の転写産物であるRNAが蓄積することが分かりました。また、遺伝子のプロモーターレポーター解析から、この遺伝子は傷口に近い細胞とそこから生じるカルスで特異的に発現が促進することを明らかにしました（図2）。この結果は、WIND1タンパク質が植物の傷ストレスからのカルス形成機構に何らかの役割を持っている可能性を示すものです。

（3）WIND1遺伝子を過剰発現させるとカルスが誘導

植物体内で過剰に遺伝子発現を誘導するプロモーター（カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター）を用いて、WIND1遺伝子の機能を調べる実験を行いました。35SプロモーターでWIND1遺伝子を強制的に発現させたシロイヌナズナ植物体では、その発現量の大きさに相関して植物体の成長が阻害され、特に発現量の大きいものは、植物体表面のいたるところにカルス（35S:WIND1カルス）を形成しました（図3）。DNAマイクロアレイ法による解析から、この35S:WIND1カルスでの遺伝子発現のパターンは、通常法で誘導したカルスととてもよく似ていることが分かりました。さらに面白いことに、カルスは通常オーキシンやサイトカイニンなどの植物ホルモンを含む培地で継代培養（一定期間毎に細胞を新しい培地に移して増殖させながら細胞株を維持する培養）しますが、35S:WIND1カルスは、植物ホルモン無添加の培地でも継代培養が可能で、誘導から3年以上経った2011年3月現在も良好に増殖を続けています。この結果は、WIND1タンパク質がカルスの誘導だけでなく、カルス状態の維持にも関わり、同時に、植物ホルモンへの応答に影響を与えている可能性を示すものです。

（4）WIND1遺伝子の発現をオフにするとカルスが再分化

培地へ薬剤を添加して遺伝子発現のタイミングを制御することができる遺伝子発現誘導系を用いて、WIND1遺伝子の機能についてさらに解析を進めました。その結果、WIND1遺伝子の発現誘導系を導入した植物（WIND1発現誘導系植物）でも、WIND1遺伝子の発現で植物体や組織片でカルス形成が促進しました。興味深いことに、このカルスは、誘導剤を含む培地で6カ月継代培養した後に誘導剤を除きWIND1遺伝子の発現誘導を抑えると、低頻度ながら茎葉や根に再分化したことから（図4）、WIND1が誘導したカルスが多分化能を獲得していることが分かりました。さらに、WIND1発現誘導系植物の芽生えを共焦点レーザー顕微鏡で詳細に調べた結果、カルス細胞は胚軸や子葉の表皮細胞からも出てきていることが分かりました。胚軸や子葉の表皮細胞は、種子の中で植物の胚が形成される時にすでに分化し、細胞の特異的な機能を獲得していることが知られています。これらの結果から、WIND1タンパク質が植物細胞の脱分化を促進する因子であることが判明しました。

（5）WIND1タンパク質は傷ストレスで誘導される脱分化を制御する

植物の転写活性化因子※4の機能を転写抑制因子※4に変換し、ドミナントネガティブ※9な表現型を持つ植物体を作り出すCRES-T法※10を用いて、傷害部位におけるWIND1遺伝子の機能を調べました。具体的には、WIND1遺伝子とSRDXと呼ばれる転写抑制ドメインの遺伝子配列をつなげた分子(WIND1-SRDX)を作り、これをWIND1遺伝子自身のプロモーター領域下で発現するようにして植物体に導入しました。これにより、WIND1遺伝子が発現する部位で、機能重複する内在性の他の転写因子の働きも抑えながら、WIND1タンパク質そのものの機能を抑制することが可能になります。この分子を発現する植物体（WIND1機能抑制植物）を用いて傷口でのカルス形成能を評価しました。その結果、野生型の植物体に比べてWIND1機能抑制植物体では傷口からのカルス形成が抑制されていました。培地に植物ホルモン（オーキシンとサイトカイニン）を添加し、カルス形成をより促進させる実験でもカルス形成は抑制されました。これらの結果から、WIND1タンパク質は傷ストレスによって誘導され、傷口で脱分化を促進する分子であることが明らかとなりました。

（6）WIND1タンパク質は植物ホルモンの一種サイトカイニンへの応答性を高める

添加する植物ホルモン（オーキシン及びサイトカイニン）の濃度比を変えた培地で植物組織片を培養し、WIND1タンパク質の植物ホルモン応答への影響を調べました。その結果、WIND1機能抑制植物はサイトカイニン応答の指標である茎葉への再分化を抑えるのに対し、オーキシン応答の指標である根への再分化は抑えませんでした。実際、マーカーを使ってサイトカイニン応答を可視化したところ、傷ストレスを受けた野生型の植物体では、傷害部位で約24時間後からサイトカイニン応答が見られ、48時間後には強いサイトカイニンへの応答活性を観察したのに対し、WIND1機能抑制植物では、48時間以降もサイトカイニンへの応答活性を観察できませんでした。また、サイトカイニン応答系が弱まったシロイヌナズナの遺伝子変異株でWIND1遺伝子を強制的に発現させても、カルス形成の頻度が下がることを確認しました。これらの結果から、WIND1タンパク質は植物ホルモンの一種サイトカイニンへの応答性を高めることで、脱分化を促進することが分かりました（図5）。

本研究では、WIND1がカルス化を誘導する転写因子であることを産総研が発見し、その詳細な機能について理研が解析しました。なお、成果の一部は、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）の「生物機能活用型循環産業システム創造プログラム・省エネルギー技術開発プログラム／植物機能を活用した高度モノづくり基盤技術開発／植物の物質生産プロセス制御基盤技術開発（植物の統括的な遺伝子発現制御機能の解析）」（平成21年度終了）の支援によって得られたものです。

今後の期待

本研究は、植物が傷ストレスに応じて細胞を脱分化させる制御機構の一端を分子レベルで解明し、WIND1タンパク質がそのスイッチとして働く転写因子の1つであることを明らかにしました。具体的には、傷口で発現し機能するWIND1タンパク質が、植物ホルモンの一種であるサイトカイニンへの応答を高め、細胞の脱分化を促進することを突き止めました。植物の傷口でサイトカイニン応答が高められるという可能性を示唆する報告は1986年にありましたが、今回の結果はその予測を分子レベルで明らかにする結果となりました。

研究グループではすでに、WIND1タンパク質の詳細な発現制御機構の解明やWIND1タンパク質が発現を制御する遺伝子の同定という新たな課題に取り組んでおり、植物の複雑な分化全能性発揮の全体像をより明確にすることを目指しています。

さらに、今回の研究成果を基に、種苗産業や花卉・園芸産業、植物を用いた医薬品原料生産産業などの植物系産業で、分子スイッチを利用した効率的な脱分化・再分化技術（分子組織培養）の確立を目指しています。WIND1タンパク質の機能をオンにすることで、通常法では脱分化細胞の誘導と維持が困難な植物種や組織で細胞株の樹立が容易になり、それらの細胞株で細胞の大量増殖をした後に再分化を促進（WIND1タンパク質の機能をオフ）することで、クローン増殖や、有用物質生産が可能になると考えられます。このような技術により、優良品種の大量栽培、飛躍的な生産性向上に向けた分子育種、有用物質生産のための新形質の付与など、多様な植物品種の効率的な育成が可能になると考えています（図6）。わが国では、歴史的に組織培養に関する高い知見とノウハウが学術界のみならず民間レベルでも高度に蓄積されているため、本研究成果を活用した技術でそれらをバックアップして産業の活性化につなげたいと考えています。

このように今回の研究成果は、基礎科学にも応用科学にも発展を促すことが予想できます。研究グループはWINDという分子の名前にも、この研究成果が生命科学、特に植物細胞の脱分化研究に新しい風（wind）を吹き込む一因となるようにとの願いを込めています。

発表者

理化学研究所
植物科学研究センター 細胞機能研究ユニット
ユニットリーダー 杉本 慶子（すぎもと けいこ）
基礎科学特別研究員 岩瀬 哲（いわせ あきら）
Tel: [phone] / Fax: [phone]

独立行政法人産業技術総合研究所
生物プロセス研究部門 主幹研究員
兼 遺伝子転写制御研究グループ 研究グループ長
高木 優（たかぎ まさる）
Tel: [phone]

お問い合わせ先

横浜研究推進部 企画課
Tel: [phone] / Fax: [phone]

報道担当

独立行政法人理化学研究所 広報室 報道担当
Tel:[phone] / Fax:[phone]

独立行政法人産業技術総合研究所 広報部 報道室
Tel: [phone] / Fax: [phone]

補足説明

· 1.カルス
植物が傷口に作る細胞の塊のこと。癒傷（ゆしょう）組織ともいう。現在では、植物の組織培養で形成される不定形の細胞塊のことを広く示す。植物の体細胞が脱分化して生じると考えられているが、根を再分化しやすい状態や茎葉を再分化しやすい状態をとるなど分化状態は必ずしも均一ではない。これにはカルス細胞内の植物ホルモン（特にオーキシンとサイトカイニン）濃度のバランスや応答性の変化が関与していると考えられる。

· 2.分化、脱分化、再分化
細胞の分化とは、未熟な性質を持った細胞が、より特定の機能を有した細胞に変化することを意味する。例えば、1つの受精卵は細胞分裂をしながらさまざまな機能を持った組織細胞を形成していくが、これは受精卵が分化していく過程である。脱分化は逆に、一度分化し特定の機能を持った細胞がより分化状態の低い細胞に変化することを指す。例えば、形態的にも機能的にも分化し細胞分裂能を失った細胞が、細胞分裂を再開し、再び何かの細胞に分化する能力を獲得した場合、その細胞は脱分化したといえる。脱分化にはさまざまな度合いがあり、少し前の分化状態に戻ることや受精卵のような状態に戻ることのいずれも含む。また、必ずしも細胞の分化の道筋を戻る状態だけに使われるのではなく、がん細胞の形成など、もともと分化の道筋にはない現象も脱分化とみなされる。一度脱分化した細胞が何かに分化するとき、その過程を再分化という。

· 3.シロイヌナズナ
アブラナ科の植物。「ぺんぺん草」で知られるナズナの近縁種である。シロイヌナズナは、植物のモデル生物（普遍的な生命現象の解明に用いられる代表的な生物）の1つ。持っている遺伝子の総量が比較的少なく、発芽から開花し種子が採れるまでの時間が比較的短いことから、被子植物の代表選手として世界中で研究対象になっている。2000年に植物としては初めて全遺伝子の解読が終了したことから、特に分子生物学分野で活躍している。

· 4.転写因子、転写活性化因子、転写抑制因子
特定のDNA配列に結合し遺伝子発現を制御するタンパク質の一群。遺伝子発現を促進する場合と抑制する場合があり、特に前者を転写活性化因子または転写促進因子、後者を転写抑制因子と呼ぶ。

· 5.植物ホルモン、オーキシン、サイトカイニン
植物ホルモンは、植物によって生産され低濃度で植物の生理過程を調節する成長調節物質の総称で、オーキシンやサイトカイニンもこの中に含まれる。サイトカイニンは、オーキシン存在下で細胞分裂や茎葉形成を促進する一群の因子と定義されている。

· 6.組織培養
動物や植物などの組織の一部を取り出して、試験管内の培地で維持したり、培養して増やしたりする技術のこと。植物分野では、種子をつけない植物を大量に増やしたり、ウイルスに感染していない植物を作り出すなど、広く応用されている。

· 7.分化全能性
1つの細胞が個体を構成する全ての細胞種に分化できる潜在能力のこと。植物細胞では、葉肉細胞のプロトプラストや花粉の細胞からカルス化を経て個体を再生できることから、分化全能性を有していると考えられている。

· 8.プロモーターレポーター解析
ある特定の遺伝子のプロモーター領域に、β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子や緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子などのレポーター遺伝子をつないで生体内で発現させ、レポーター遺伝子の発現をモニターすることで、その遺伝子がいつ、どの部位で、どんな刺激に応答して遺伝子発現が行われているかなどを観察する解析方法。

· 9.ドミナントネガティブ
ある遺伝子に偶然または人為的に変異が入った時に、その変異遺伝子産物（タンパク質）が正常な遺伝子由来のタンパク質に対して優位（ドミナント）に働いて、かつ正常な遺伝子由来のタンパク質の作用を阻害するとき、ドミナントネガティブ作用が起こるという。

· 10.CRES-T法
CRES-TはChimeric REpressor gene-Silencing Technologyの略。転写活性化因子にSRDXという強い転写抑制能を有する短いアミノ酸配列を付与することで、転写活性化因子を強い転写抑制因子（キメラリプレッサー）に変換する技術。特定の6アミノ酸を付与することで効果があることが明らかになっている。キメラリプレッサーを発現した植物では、ドミナントネガティブな表現型を示す。これは、キメラリプレッサーが内在性の転写因子だけでなく、機能重複する転写因子の転写活性能に優先して標的遺伝子の発現を抑制するためと考えられている。現在植物科学では、強い転写活性化能を付与するVP16と並んで、転写抑制化能を付与するアミノ酸配列としてSRDXが広く用いられている。

図1　植物の脱分化細胞からWIND1遺伝子を選抜した

モデル植物であるシロイヌナズナを用いて、脱分化した細胞で発現が促進している遺伝子を探索した。植物体と3種類のカルス細胞株に対してDNAマイクロアレイ法による網羅的遺伝子発現解析を行い、分化した植物細胞に比べて3種類のカルス細胞株で共通に発現が促進している遺伝子を選抜した。研究グループはその中から、転写因子の遺伝子に注目し、今回の研究成果に基づいて、この遺伝子をWound INduced Dedifferentiation (WIND）1と名付けた。

図2　WIND1遺伝子は傷口で発現が促進する

WIND1遺伝子のプロモーターレポーター解析（図中の青く染まっている部分が、WIND1遺伝子が発現していると考えられる部位）から、WIND1遺伝子は、傷口に近い細胞（写真左）とそこから生じるカルス（写真右）で特異的に発現が促進することが分かった。

図3　WIND1過剰発現植物はカルスを形成する

WIND1遺伝子をシロイヌナズナ植物体で過剰に発現させると、発現量の大きい植物体ではカルスを形成した。

図4　WIND1発現誘導系カルスはWIND1の誘導を止めると再分化する

WIND1遺伝子の発現誘導系を導入した植物でも、WIND1遺伝子の発現で、植物体や組織片でカルス形成が促進した。このカルスを、誘導剤を含む培地で6カ月継代培養した後に誘導剤を除き、WIND1遺伝子の発現誘導を抑えたところ茎葉や根を再分化した。このことからWIND1で誘導されたカルスは、多分化能を獲得していることが分かった。

図5　WIND1タンパク質は傷ストレスで誘導される脱分化を制御する

傷口で発現し機能するWIND1タンパク質が、植物ホルモンの一種であるサイトカイニンへの応答を高め、細胞の脱分化を促進することが分かった。

図6　WIND1タンパク質の機能を利用した分子組織培養法の確立を目指す

研究グループは、種苗産業や花卉・園芸産業、植物を用いた医薬品原料生産産業などで、分子スイッチを利用した効率的な脱分化・再分化技術（分子組織培養）の確立を目指している。これにより優良品種の大量栽培、飛躍的な生産性向上に向けた分子育種、有用物質生産のための新形質の付与など、これまでわが国で蓄積された高いノウハウをバックアップすることができると考えている。

注2(日文未译)

2015年6月30日

理化学研究所

植物の分化全能性抑制の分子メカニズムの一端を解明

―ヒストンのメチル化で一度分化した細胞の脱分化を抑えるー

要旨

理化学研究所（理研）環境資源科学研究センター細胞機能研究チームの池内桃子基礎科学特別研究員、岩瀬哲研究員、杉本慶子チームリーダーらの研究チームは、植物が分化全能性[1]の発揮を抑えることで細胞が分化を完了した状態を維持していることを明らかにしました。

多細胞生物の体が構築される過程では、分化全能性を持った受精卵が細胞分裂と細胞分化を繰り返し、最終的に特殊な構造と生理機能を持ったさまざまな細胞となります。秩序立った多細胞の体を維持するためには、分化が完了した細胞をその状態に留めておかなくてはいけません。一方、植物は分化が完了した細胞であっても単離・培養することで分化全能性を発揮し個体を再生します。しかし、植物細胞の分化全能性が通常の個体発生や分化の過程でどのように抑制されているのかは分かっていませんでした。

研究チームは、シロイヌナズナ[2]の「PRC2(Polycomb repressive complex 2)[3]」というタンパク質複合体の機能が欠損したPRC2変異体では、根毛細胞が細胞分裂を開始し、不定形の細胞塊であるカルス[4]と不定胚[5]を形成することを発見しました。不定胚の形成は分化全能性発揮の１つの指標です。さらに、このPRC2変異体の根毛細胞では、核内倍加[6]を経て、一度正常に分化した根毛細胞がカルス化と不定胚形成をしていることを明らかにしました。

PRC2はヒストン[7]H3タンパク質を構成するアミノ酸のうち27番目のリジンをメチル化することで、クロマチン構造[8]を閉じた状態に変化させ、ゲノムの特定領域での遺伝子発現を抑えます。研究チームは、シロイヌナズナの根のゲノム上で、どの遺伝子がPRC2によって発現を抑えられているかを網羅的に調べました。その結果、研究チームが以前発見した脱分化促進因子の「WIND3注1）」[9]や胚発生制御因子の「LEC2」などの遺伝子発現が抑えられていることを見いだしました。また、WIND3遺伝子やLEC2遺伝子を強制的に発現させることで、PRC2の機能が正常に働いている植物でも根毛細胞からカルスを誘導できることも分かりました。

今回、植物が通常の発生・成長の過程で、細胞分化が完了した後に分化全能性を抑制する分子メカニズムがあることを示しました。そして、この分子メカニズムはヒストンの化学修飾による脱分化促進因子の遺伝子発現抑制であることを明らかにしました。今後、効率の良い組織培養[10]による植物の量産などへの活用が期待できます。

本研究は、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構生物系特定産業技術研究支援センターのイノベーション創出基礎的研究推進事業、農林水産省の農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業、日本学術振興会の科学研究費助成事業の支援を受けて実施されました。成果は英国の科学雑誌『Nature Plants』に掲載されるのに先立ち、オンライン版（6月29日付け:日本時間6月30日）に掲載されます。

· 注1）2011年3月11日プレス発表「植物細胞の脱分化を促進するスイッチ因子を発見」

背景

多細胞生物の体が構築される過程では、分化全能性を持った受精卵が細胞分裂と細胞分化を繰り返し、最終的に特殊な構造と生理機能を持ったさまざまな細胞となります。秩序立った多細胞の体を維持するためには、分化が完了した細胞をその状態に留めておかなくてはいけません。

一方、植物が高い再生能力を有していることは古くから知られています。挿し木などで行われている組織レベルの話だけでなく、分化が完了した1つの細胞からでも個体を再生させることができます。これは植物細胞が分化全能性を持っていることを示しており、1950年代末から1970年代の多くの研究から導かれました。現在でも、優良品種の量産や品種改良などは、この能力に基づいた技術で行われ、種苗・育種産業の基盤となっています。他生物との比較から、植物細胞の分化全能性はしばしば植物を特徴づける性質と考えられていますが、一方で、植物は通常の発生や分化の過程で不必要な分化全能性の発揮を抑えなくてはなりません。しかし、それがどのようなメカニズムでなされているのか、これまで分かっていませんでした。

研究手法と成果

研究チームは、植物細胞の脱分化（分化した細胞が、より未分化な状態に戻ること）の分子メカニズムを解明するため、遺伝子の機能獲得や機能欠損によってカルス化するシロイヌナズナ変異体の解析を進めています。その過程で、高等真核生物に広く保存された「PRC2(Polycomb repressive complex 2)」というタンパク質複合体の機能が欠損したPRC2変異体で、根毛細胞をはじめとするさまざまな細胞が時間の経過とともに至る所でカルス化し、さらにその一部が不定胚を形成すること発見しました（図1）。不定胚の形成は分化全能性発揮の１つの指標です。

根毛細胞は、根の表皮細胞の一部が伸長成長によって外に張り出し巨大化した1個の細胞です。シロイヌナズナの根毛細胞は、細胞の分裂を経ずにDNA複製のみが進行する核内倍加という特殊な細胞周期によって核の中のDNA量が増加し、水分や無機塩類を土壌中から吸収する高度に機能化した最終分化細胞です。研究チームは、「PRC2変異体では、最終分化細胞の分化状態の維持ができずにカルス化や不定胚の形成が起きている」という仮説を立て、この現象とその原因について詳細に調べました。

まず、根毛細胞のカルス化が、本当にPRC2の機能欠損によって起きるのかを調べました。PRC2は、大きく分類すると4つのタンパク質サブユニットからできています。研究チームはそのうち3つのサブユニットに関して、それぞれの機能が欠損した変異体を用いて、形質を観察しました。その結果、どのサブユニットの変異体でも根毛細胞がカルス化しました。これはカルス化が、PRC2の機能の消失によって起きていることを示しています。また、プロモーターリポーター解析[11]から、PRC2を構成するタンパク質は、根で発現していることを確認しました。

長く伸びた根毛細胞がカルス化する過程には、細胞分裂しながら伸長するか、または一旦は核内倍加・細胞伸長を完了した後に分裂するかの2つの可能性が予想できます。DAPI染色[12]や蛍光タンパク質を用いて根毛細胞の核や細胞膜を可視化したところ、初めはPRC2変異体でも野生株と同様に、1つの根毛細胞に1つの大きな核が形成されていました。このことは、PRC2変異体の根毛細胞が、核内倍加した後に分裂していることを示唆します。

そこで、核内倍加した後に分裂していることをさらに確かめるため、核内倍加の度合いや、核の大きさ、染色体中心の大きさを指標として細胞分裂開始前の根毛細胞について調べました。細胞分裂が盛んな根の分裂組織と根毛細胞を、野生株とPRC2変異体で比較したところ、どの指標においても、PRC2変異体は野生株と同程度の値を示しました。すなわち、分裂組織ではどちらも同程度の小さな核を持ち、根毛細胞ではどちらも同程度の大きな核を持っていました。これはPRC2変異体の根毛細胞は、野生株と同様に正常な細胞分化を行っていること意味します。その後、時間の経過とともにPRC2変異体のみが細胞分裂して多細胞化している（図1中上）ことから、PRC2変異体の根毛細胞は一度伸長し、巨大な1つの細胞になってから、つまり核内倍加後に分裂していることを確認できました。また、根毛細胞だけでなく大きな核を持つ皮層細胞が分裂する様子も動画で捉えることに成功しました。

高等真核細胞では、PRC2がヒストンH3タンパク質を構成するアミノ酸のうち27番目のリジンにメチル基を付加することで、クロマチン構造が閉じられる状態を作ることが知られています。メチル化されたヒストンはゲノムの特定の領域に結合し、その領域にある遺伝子発現を抑えます。クロマチン免疫沈降法[13]を用いて、シロイヌナズナのゲノム上で、どこの領域の遺伝子がPRC2によって発現を抑えられているかを網羅的に調べました。その結果、研究チームがこれまで明らかにした植物細胞の脱分化因子の1つ「WIND3」や、不定胚形成を促進させる「LEC2」などの遺伝子発現が抑えられていることが分かりました。実際、PRC2変異体の根ではこれらの遺伝子発現が上昇していました。また、WIND3やLEC2を過剰に発現させることで、根毛細胞を分裂させカルスを形成させることに成功しました。さらに、PRC2変異体の中でこれらの遺伝子の働きを抑えると、根毛細胞の多細胞化も抑えられました。

これらの解析から、根毛細胞などの一度分化した植物細胞には、細胞が脱分化しないように抑えるメカニズムがあり、それがヒストンのメチル化を介したクロマチン構造の制御によって行われていることが分かりました（図2）。これは、植物が通常の発生・成長の過程、特に細胞分化が完了した後でも分化状態を維持するメカニズムがあることを示した上に、そのメカニズムの一端を細胞・分子レベルで明らかにしたと言えます。

今後の期待

LEC2やWIND3遺伝子の過剰発現によって引き起こされる根毛細胞のカルス化の頻度は、PRC2変異体よりも低いことや、これらの因子の発現抑制による多細胞化の抑制も完全でないことから、PRC変異体で観察さる根毛細胞の脱分化には、他にもさまざまな因子が関与していることが予想されます。今後、それらの因子を探索することで、植物細胞がPRC2を通してどのように分化状態を維持するのか、その分子メカニズムの詳細が明らかになると期待できます。同時に、植物の新規脱分化誘導因子の発見も期待できます。

また今回の研究で、ヒストン修飾因子の制御によって、分化した植物細胞の脱分化が誘導できることが示されました。これまで脱分化や再分化が困難であった植物種において、クロマチン状態を操作することで、効率的な脱分化・再分化技術の開発が可能になるかもしれません。

原論文情報

· Momoko Ikeuchi, Akira Iwase, Bart Rymen, Hirofumi Harashima, Michitaro Shibata, Mariko Ohnuma, Christian Breuer, Ana Karina Morao, Miguel de Lucas, Lieven De Veylder Justin Goodrich, Siobhan M. Brady, Francois Roudier and Keiko Sugimoto, "PRC2 represses dedifferentiation of mature somatic cells in Arabidopsis", Nature Plants, doi: 10.1038/NPLANTS.2015.89

発表者

理化学研究所
環境資源科学研究センター 細胞機能研究チーム
チームリーダー 杉本 慶子（すぎもと けいこ）
基礎科学特別研究員 池内 桃子（いけうち ももこ）
研究員 岩瀬 哲（いわせ あきら）

発表者の岩瀬 哲（左）、杉本慶子（中央）、池内桃子（右）

報道担当

理化学研究所 広報室 報道担当
Tel: [phone] / Fax: [phone]

補足説明

· 1.分化全能性
1つの細胞が個体を構成する全ての細胞種に分化できる潜在能力のこと。受精卵は分化全能性を有している。植物細胞では、葉肉細胞のプロトプラストや花粉の細胞からカルス化を経て個体を再生できることから、分化を完了した細胞においても分化全能性を発揮できる。

· 2.シロイヌナズナ
アブラナ科の植物。植物のモデル生物（普遍的な生命現象の解明に用いられる代表的な生物）の1つ。2000年に植物として初めて全ゲノムが解読された。

· 3.PRC2 (Polycomb repressive complex 2)
タンパク質複合体の1つ。ヒストンH3を構成するアミノ酸のうち27番目のリジン残基をトリメチル化する機能を持つ。ショウジョウバエで発見されたが、高等真核生物が広く持っている。細胞分化においてさまざまな機能を持つことが明らかになっている。

· 4.カルス
植物が傷口に作る不定形の細胞塊。癒傷（ゆしょう）組織とも言う。現在では、植物の組織培養で形成される不定形の細胞塊のことを広く示す。カルスが形成されることをカルス化という。

· 5.不定胚
受精卵からではなく、体細胞から生じる胚。通常の受精卵と同様な形態的変化の過程をとることが知られている。組織培養条件下では、単離した1つの体細胞から不定胚を経由し、完全な植物体を作ることから、不定胚形成は分化全能性発揮の1つの指標となる。

· 6.核内倍加

細胞の分裂を経ずにDNA複製のみが進行すること。1つの細胞中の核内DNA量が増加する現象。真核生物に広く見られる現象で、特に植物では頻繁に起きる。核内倍加を経た細胞では、多くの場合細胞の巨大化が起きる。また、近年では核内倍加を止める機構も明らかにされている注2,3,4)。

·

· 注2）2007年12月4日プレス発表「DNAの量によって植物の大きさが決まる新たな仕組みを解明（PDF 547.1KB）」

· 注3）2009年8月11日プレス発表「細胞分裂の調節に必須の新しい「HPY2」遺伝子を発見」

· 注4）2009年9月1日プレス発表「植物細胞の大きさを調節する新たな遺伝子「GTL1」を発見」

· 7.ヒストン
DNAを巻きつけて核の中に収納するタンパク質。コアヒストンとしては、H2A、H2B、H3、H4の4種類がある。H2AとH2B、H3とH4が結合したものがさらに結合し8量体を形成する。それぞれのヒストンタンパク質が、メチル化、アセチル化、ユビキチン化などの化学修飾を受け、それが遺伝子発現などに影響を与えることが明らかになりつつある。

· 8.クロマチン構造
DNAがヒストンタンパク質に巻き付いたものをヌクレオソームと呼ぶが、このヌクレオソームが凝集したものをクロマチンと呼ぶ。クロマチン構造は、クロマチンが立体的にどのような状態になっているかを表す。凝集が強い場合は、DNAに転写因子などが結合できず遺伝子の発現制御ができないが、凝集が弱い状態だと、DNAがさまざまな因子の影響を受けやすくなる。このように、クロマチン構造は単にDNAをパッケージするためだけでなく、遺伝子の発現制御にも関与することが分かっている。

· 9.WIND3
WIND3はWOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION3の略。転写因子は、特定のDNA配列に結合し遺伝子発現を制御するタンパク質の一群。WIND3転写因子は研究チームが2011年に報告している、WIND1転写因子のパラログ因子。WIND1同様、傷ストレスによって発現が上昇し、植物細胞の脱分化に関与することが分かっている。

· 10.組織培養
動物や植物など、体の組織の一部を取り出して、試験管内の培地で維持したり、培養して増やしたりする技術。植物分野では、種子をつけない植物の増産や、茎頂の分裂組織を培養してウイルスに感染していない植物を作り出すなど、広く応用されている。

· 11.プロモーターリポーター解析
ある遺伝子のプロモーター領域に、β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子や緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子などのレポーター遺伝子をつないで生体内で発現させ、レポーター遺伝子の発現をモニターすることで、その遺伝子がいつ、どの部位で、どんな刺激に応答して遺伝子発現が行われているかなどを観察する解析方法。

· 12.DAPI染色
DAPI（4, 6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）は、二本鎖DNAのAT領域に結合する。紫外線を当てることで青色蛍光を発する性質を持つことから、核DNAの染色に使われる。この染色のことをDAPI染色という。

· 13.クロマチン免疫沈降法
生体内におけるタンパク質とゲノムDNAの結合部位を検出するための実験手法。ホルムアルデヒドによってDNAとDNAに結合しているタンパク質を架橋したのちに、DNAの断片化を行い、タンパク質の抗体を用いてタンパク質-DNA複合体を回収する。さらにDNAとタンパク質を脱架橋し、DNAのみを回収し配列を調べることでタンパク質がゲノムのどこに結合していたかが分かる。

図1　PRC2変異体の根毛が分裂・脱分化し不定胚を形成する様子

蛍光色素DAPIで染色した野生株の根毛細胞には、核が1つ確認される（上）。PRC2変異株では多核になっていることが確認された（中上）。時間の経過とともに、PRC2変異株の根毛細胞ではカルス化が起き（中下）、さらには不定胚を形成するものも観察された（下）。

図2　PRC2による脱分化関連遺伝子の発現抑制

PRC2（赤）は、分化した根毛細胞や根の細胞（青）においてWINDやLEC2などの遺伝子の発現を、直接的（実線）・間接的（破線）に抑えることで、細胞の脱分化を抑え、分化が完了した状態を維持している。

注3(日文未译)

2017年1月17日

理化学研究所

植物が傷口で茎葉を再生させる仕組み

－組織培養による植物の量産や有用物質生産に期待－

要旨

理化学研究所（理研）環境資源科学研究センター細胞機能研究チームの岩瀬哲研究員、杉本慶子チームリーダーらの研究チームは、植物が傷口で茎葉を再生させる分子経路の一端を明らかにしました。

植物の高い再生能力は、挿し木や葉挿しなど、農業や園芸分野で古くから植物体の増産に利用されています。しかし、植物がどのように傷口で新しく組織を再生させるか、その分子レベルでのメカニズムはよく分かっていませんでした。

研究チームは2011年、シロイヌナズナ[1]の傷口で細胞の脱分化[2]を促進する転写因子[3]「WOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION 1（WIND1）」を発見しました。WIND1によって発現がオンになる遺伝子を探索したところ、転写因子「ENHANCER OF SHOOT REGENERATION 1（ESR1）」が一つの候補に挙がりました。今回、このESR1に着目し、傷口での機能を調べました。その結果、傷口でESR1遺伝子が発現し、カルス[4]（脱分化した植物細胞の塊）形成やカルスから生じる茎葉の再生を促進することが分かりました。また、WIND1がESR1遺伝子のプロモーター[5]領域に結合し、ESR1遺伝子の発現を直接的に促進していることが明らかになりました。つまり、シロイヌナズナが傷口で茎葉を再生させる際には、少なくともWIND1とESR1の二つの転写因子が階層的に機能するということです。これらの結果は、植物には傷ができた後に、カルス形成を通して茎葉を再生させる分子経路が存在することを示しています。

今後、WIND1とESR1を直接利用したり、ESR1が制御する遺伝子群を特定していくことで、効率のよい組織培養[6]による植物の量産や有用物質生産などへ繋がる可能性があります。

成果は米国の科学雑誌『The Plant Cell』オンライン版（12月23日付け）に掲載されました。

本研究は、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構生物系特定産業技術研究支援センターのイノベーション創出基礎的研究推進事業、農林水産省の農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業、日本学術振興会の科学研究費助成事業の支援を受けて実施されました。

背景

植物の高い再生能力は古くから知られ、現在でも農業や園芸分野で広く利用されています。挿し木や葉挿しなどは、切り取った組織の一部を土に埋めて放置し、再生する植物体を育成してクローン植物を増やす手法です。また、植物の中には、ちぎれた葉から個体を再生させ、繁殖に利用する種もあります。

再生能力が高いことで知られる動物、例えばプラナリアやイモリなどと同様に、植物の再生においても組織が傷を受けることが再生の引き金になっています。しかし、傷がどのように組織の再生を促すのか、その分子レベルでのメカニズムは、近年までほとんど分かっていませんでした。

傷を受けた生物の再生には、一度分化が完了した細胞から分化多能性を持った幹細胞[7]が新しく生み出される「脱分化」という現象を経るものがあります。興味深いことに、植物では脱分化に関与する因子の発現を制御すると、多くの場合、カルスが形成されるだけでなく、茎や葉など、さまざまな組織が再生されます。自然界でもカルス形成の後に組織の再生が観察されることから、カルス形成と組織の再生は連動した経路であることが予想されます。

研究チームは、植物細胞の持つ分化全能性[8]、すなわち一つの細胞が個体をつくる全ての細胞に分化できる能力を発揮する一連のメカニズムについて分子レベルで解析を進めています。2011年には、シロイヌナズナの傷口で細胞の脱分化を促進する転写因子「WOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION 1（WIND1）」を発見しました注１）。また2015年には、通常の発生・成長の過程では、全能性の発揮を抑える因子「PRC2(Polycomb repressive complex 2)」が必要であることを明らかにしています注2）。

今回、研究チームは2011年に発見したWIND1を足掛かりに、傷が組織の再生を促す際に関わる因子を探索しました。

注1）2011年3月11日プレスリリース「植物細胞の脱分化を促進するスイッチ因子を発見」
注2）2015年6月30日プレスリリース「植物の分化全能性抑制の分子メカニズムの一端を解明」

研究手法と成果

研究チームは、先行研究としてWIND1遺伝子を過剰発現させた植物体（シロイヌナズナ）でどのような遺伝子が発現しているかをDNAマイクロアレイ法[9]を用いて調べました。その結果、転写因子「ENHANCER OF SHOOT REGENERATION 1（ESR1）」の遺伝子が多く発現していることが分かりました。ESR1遺伝子は、植物ホルモン[10]を添加して茎葉の再生を誘導する組織培養条件で発現量が増え、茎葉の再生を促進する因子であることが報告されています注3）。このため、傷口で発現しカルス形成を誘導するWIND1がESR1遺伝子の発現を制御しているのではないかという仮説を立てました。

傷口でWIND1がESR1遺伝子の発現を制御しているのであれば、傷口でESR1遺伝子の発現が促進されるはずです。実際、RT-qPCR法[11]によってESR1遺伝子の発現量を複数の組織の傷口で測定したところ、どの組織でも、傷つけてから数時間以内に発現量が上昇しました。また、プロモーターレポーター解析[5]においても、傷口の維管束柔組織や前形成層の細胞、維管束の周りの葉肉細胞で特異的にESR1遺伝子のプロモーター領域の活性が確認されました。プロモーターとは、ある遺伝子が発現し転写される際に、その遺伝子の発現を調節するDNA上の領域のことです。さらに、ESR1に緑色蛍光タンパク質（GFP）をつないだESR1-GFPタンパク質をESR1プロモーターで発現させたシロイヌナズナ（ESR1-GFP）でも、傷口の細胞の核で蛍光が観察されました。傷をつけた後のWIND1遺伝子の発現がESR1遺伝子より先に見られたこと、また、WIND1の機能を抑制したシロイヌナズナ（WIND1-SRDX）ではESR1遺伝子の発現が抑えられたことから、実際にWIND1がESR1遺伝子の発現を制御していることが示されました。

次に、WIND1がどのようにESR1遺伝子の発現を制御しているのかを調べました。WIND1が、ESR1遺伝子のプロモーター領域に直接結合して遺伝子発現を制御するのか、または別の因子を介してESR1遺伝子を制御するのかを明らかにすることは、傷ストレスによる茎葉再生の分子経路を理解するために重要です。研究チームは、クロマチン免疫沈降（ChIP）法[12]とゲルシフトアッセイ（EMSA）法[13]という異なる二つの手法によって、WIND1が直接ESR1遺伝子のプロモーター領域に結合することを明らかにしました。これによって、シロイヌナズナの傷口ではWIND1→ESR1という二つの転写因子が階層的に機能する分子経路が存在することが示されました。

さらに、研究チームは、ESR1遺伝子が傷口のカルス形成に関わるかを調べました。ESR1遺伝子の機能を抑制したシロイヌナズナ（esr1とESR1-SRDX）および、ESR1遺伝子が多く発現するようにしたシロイヌナズナ（esr1-DとESR1-GFP）を用い、傷口でのカルス形成能を野生株と比較しました。その結果、野生株と比べ、esr1とESR1-SRDXはカルス形成が抑制され、esr1-DとESR1-GFPはカルス形成が促進されました。これにより、ESR1遺伝子は傷口において、カルス形成を促進する機能を持つことが明らかになりました。

続いて、ESR1-GFPタンパク質をESR1プロモーターで発現させたシロイヌナズナ（ESR1-GFP）を用いて、傷をつけた組織（花茎、葉、子葉および根）を植物ホルモンを添加しない培地で培養しました。用いた野生株の場合、植物ホルモンを添加した培地で培養しないと茎葉は再生しません。ところが、ESR1-GFPは植物ホルモンの添加なしに茎葉が再生しました。ESR1-GFPでは、傷をつけた後のESR1遺伝子の発現量がピーク時には野生株に比べ2倍ほど増えていたことから、傷口でESR1遺伝子の発現量を増加させると茎葉の再生が促進されると予想されました。

これを検証するため、遺伝子発現のタイミングを制御できる遺伝子発現誘導系のシロイヌナズナの葉を用いて、傷をつけた後にESR1遺伝子の発現を誘導しました。その結果、培地に植物ホルモンを添加しない条件でも、傷口からの茎葉再生が著しく促進されました（図1）。このことから、傷口でESR1遺伝子の発現量を増加させると茎葉の再生が促進されることが示されました。

ESR1も転写因子であることから、WIND1と同様に発現を制御する遺伝子（群）が存在すると考えられます。研究チームは、茎葉が著しく再生する組織培養の条件を用いて、ESR1によって茎葉再生が制御される遺伝子をRT-qPCR法で探索しました。この組織培養条件では、ESR1遺伝子の機能を抑制したesr1とESR1-SRDXは、野生株に比べて茎葉の再生が抑えられ、逆にESR1遺伝子が多く発現するようにしたesr1-DとESR1-GFPでは茎葉の再生が促進されます。組織培養条件で茎葉再生に関与することが既に報告されている12個の転写因子の遺伝子について、野生株とesr1を比較したところ、esr1ではESR2、CUC1、RAP2.6L、WUS、STMの5個の遺伝子の発現が抑制されました。この結果から、ESR1が制御する遺伝子には茎葉再生に関わる5個の転写因子が含まれることが分かりました（図2）。

これらの解析から、傷をつけたシロイヌナズナの組織には、WIND1→ESR1という転写因子のネットワークが存在し、そのネットワークによって傷口のカルス形成や茎葉再生が促進されることが明らかになりました。これは、傷を受けた植物が単に傷口でカルス形成を誘導し傷を塞ぐだけでなく、そのカルスから新しい組織を再生させるための分子経路を持つことを明らかにしたといえます。

研究チームは、WIND1が結合するESR1プロモーター領域の配列を特定し、さらにESR1遺伝子の傷口での発現が植物ホルモンのオーキシン[10]とサイトカイニン[10]によって相乗的に促進することなども明らかにしました。サイトカイニン応答に関わるARR1とARR12の機能抑制二重変異体（arr1,arr12）でも、傷ストレス後のESR1の発現量が減少することなども見いだしました（図2）。

注3）Banno, H., Ikeda, Y., Niu, Q. and Chua, N. (2001). Overexpression of Arabidopsis ESR1 Induces Initiation of Shoot Regeneration. Plant Cell 13, 2609–2618.

今後の期待

ESR1遺伝子の機能を抑制したesr1とESR-SRDXでは、カルス形成や茎葉再生が完全に抑えられるわけではありません。これは、WIND1に制御される再生関連因子が他にも存在することを示唆しています。

今後、ESR1に制御される遺伝子の探索だけでなく、ESR1と同様にWIND1によって制御される遺伝子を探索することで、傷からの再生の分子経路がより明確になります。また、植物の新しい再生関連因子の発見も期待できます。さらにWIND1やESR1だけでなく、それらの再生関連因子を用いて、効率的な脱分化・再生技術の開発が可能になると期待できます。

原論文情報

· Akira Iwase, Hirofumi Harashima, Momoko Ikeuchi, Bart Rymen, Mariko Ohnuma, Shinichiro Komaki, Kengo Morohashi, Tetsuya Kurata , Masaru Nakata, Masaru Ohme-Takagi, Erich Grotewold, and Keiko Sugimoto, "WIND1 Promotes Shoot Regeneration through Transcriptional Activation of ENHANCER OF SHOOT REGENERATION1 in Arabidopsis", The Plant Cell, doi: 10.1105/tpc.16.00623

発表者

理化学研究所
環境資源科学研究センター 細胞機能研究チーム
チームリーダー 杉本 慶子（すぎもと けいこ）
研究員 岩瀬 哲（いわせ あきら）

報道担当

理化学研究所 広報室 報道担当
Tel: [phone] / Fax: [phone]
お問い合わせフォーム

産業利用に関するお問い合わせ

理化学研究所 産業連携本部 連携推進部
お問い合わせフォーム

補足説明

· 1.シロイヌナズナ
アブラナ科の植物であり、「ぺんぺん草」で知られるナズナの近縁種である。有している遺伝子の総量が比較的少なく、発芽から開花し種子が採れるまでの時間が比較的短いことから、植物のモデル生物（普遍的な生命現象の解明に用いられる代表的な生物）の一つになっている。2000年に、植物として初めて全ゲノムが解読された。

· 2.脱分化、分化
細胞の「分化」とは、未熟な性質を持った細胞がより特定の機能を持つ細胞に変化することを意味する。例えば、一つの受精卵は細胞分裂を繰り返しながら、さまざまな機能を持った組織細胞を形成していくが、これは受精卵が分化していく過程である。「脱分化」は逆に、一度分化し特定の機能を持った細胞がより分化状態の低い細胞に変化することを指す。例えば、形態的にも機能的にも分化が完了し、細胞分裂能を失った細胞が、細胞分裂を再開し、再び何かの細胞に分化する能力（分化の多能性）を獲得した場合、その細胞は脱分化したといえる。脱分化は、少し前の分化状態に戻ったり、受精卵のような状態に戻ったりなど、さまざまな度合いがある。また、細胞の分化の道筋を戻る状態だけでなく、がん細胞の形成などのように、もともと分化の道筋にはない現象も脱分化とみなされる。

· 3.転写因子
特定のDNA配列に結合し、遺伝子発現を制御するタンパク質の一群。遺伝子発現を促進する場合と抑制する場合があり、特に前者を転写活性化因子または転写促進因子、後者を転写抑制因子と呼ぶ。

· 4.カルス
植物が傷口につくる細胞の塊のこと。癒傷（ゆしょう）組織ともいう。現在では、植物の組織培養で形成される不定形の細胞塊のことを広く示す。カルス形成は傷などのストレスによって誘発される。植物ホルモンを含む培地では、傷口以外からもカルスが生じることがある。

· 5.プロモーター、プロモーターレポーター解析
ある遺伝子が発現し転写される（DNA→RNA）際に、その遺伝子の発現を調節するDNA上の領域のことをプロモーターと呼ぶ。ある特定の遺伝子のプロモーター領域に、β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子や緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子などのレポーター遺伝子をつないで生体内で発現させ、レポーター遺伝子の発現をモニターする解析方法をプロモーターレポーター解析と呼ぶ。この方法によって、その遺伝子がいつ、どの部位で、どのような刺激に応答して遺伝子発現が行われるかなどが観察できる。

· 6.組織培養
動物や植物などの組織の一部を取り出して、試験管内の培地で維持したり、培養して増やしたりする技術。植物分野では、種子をつけない植物を大量に増やしたり、ウイルスに感染していない植物を作り出すなど、広く応用されている。多くの場合、植物ホルモンを添加する。

· 7.幹細胞
自己複製能と多分化能を併せ持つ細胞のこと。細胞分裂後の娘細胞は、元の細胞と同じ性質を維持する（自己複製）が、一方の細胞は他の細胞種に分化できる能力（多分化能）を持つ。植物では、主に芽の先、形成層、根の先に幹細胞を持っており、分裂と分化をしながらレンガを積み上げるように体づくりをしている。

· 8.分化全能性
一つの細胞が個体を構成する全ての細胞種に分化できる潜在能力のこと。受精卵は分化全能性を持っている。植物細胞では、葉肉細胞のプロトプラストや花粉の細胞からカルス形成を経て個体を再生できることから、分化を完了した細胞においても分化全能性を発揮できる。

· 9.DNAマイクロアレイ法
どんな遺伝子がどれ位発現しているかを網羅的に捉える手法の一つ。ある生物が持つ全部の遺伝子や発現を知りたい遺伝子を選んで、DNAを一つひとつプレートに貼り付けておく。調べたい細胞からmRNAを取り出して、逆転写酵素でcDNAに変換した後、さらに蛍光を発する分子をくっつけておく。このmRNA由来の蛍光標識したcDNAを、プレート上に貼付けられたDNAと反応させる。蛍光強度を読み取ることで、遺伝子の発現量を網羅的かつ定量的に調べることができる。

· 10.植物ホルモン、オーキシン、サイトカイニン
植物ホルモンは、植物によって生産され低濃度で植物の生理過程を調節する成長調節物質の総称。オーキシンやサイトカイニンも含まれる。サイトカイニンは、オーキシン存在下で細胞分裂や茎葉形成を促進する一群の因子と定義される。

· 11.RT-qPCR法
RT-qPCR；quantitative reverse transcription PCR。遺伝子の発現量を測る方法。遺伝子の発現産物であるmRNAを逆転写反応（RT: reverse transcription）によってcDNAに変換し、これを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）をする。DNAの増幅率を経時的にモニターすることで、細胞や組織内の少量のmRNAの定量を行なうことができる。

· 12.クロマチン免疫沈降（ChIP）法
生体内におけるタンパク質とゲノムDNAの結合部位を検出するための実験手法。ホルムアルデヒドによってDNAとDNAに結合しているタンパク質を架橋したのちに、DNAの断片化を行い、タンパク質の抗体を用いてタンパク質-DNA複合体を回収する。さらにDNAとタンパク質を脱架橋し、DNAのみを回収し配列を調べることでタンパク質がゲノムのどこに結合していたか分かる。ChIPはChromatin Immunoprecipitationの略。

· 13.ゲルシフトアッセイ（EMSA）法
試験管内でタンパク質とDNAの結合を検出するための実験手法。DNAがタンパク質に結合すると、電気泳動度合いが変化することを利用して結合を検知する。EMSAは、Electrophoresis Mobility Shift Assayの略。

図1　ESR1遺伝子の発現を促進させたシロイヌナズナの葉

ESR1遺伝子を発現誘導できるシロイヌナズナの葉を傷つけ、ESR1遺伝子の発現を誘導しながら21日間培養した。その結果、傷口にカルスが形成され茎葉が再生した。植物ホルモン無添加の培地を用いた。スケールバーは1mm。

図2　茎葉再生を誘導するWIND1-ESR1経路

傷ストレスによって発現する転写因子WIND1は、ESR1遺伝子のプロモーターに直接結合してESR1遺伝子の転写を活性化する。このとき、オーキシンとサイトカイニンの両方が適度に存在することで、ESR1遺伝子の発現がさらに促進する。ESR1遺伝子は下流の因子の少なくとも5個の遺伝子の発現を制御することで、傷口でのカルス形成を促し茎葉の再生を促進していると考えられる。