Science综述 | 系统地回顾生物钟扰乱对人类健康影响
昼夜节律（circadian rhythms）是生物体内生化、生理和行为功能的内在周期振荡，也是真核生物生命中几乎无处不在的特征，生物钟在大多数生命形式中的普遍性存在强烈地表明它具备选择优势。通过比较昼夜节律紊乱与正常的果蝇和小鼠的存活率，可以发现生物钟缺陷与生存几率降低有关，这使昼夜节律失调会引起疾病的假设得以提出。
生物钟功能紊乱也与多种人类疾病状态相关，包括时差反应和睡眠紊乱，可能对代谢综合征的发展有重要作用。先前的动物研究表明，通过紫外线辐射导致皮肤癌的过程中也存在强烈的昼夜节律，移植到节律紊乱的动物体内的肿瘤比移植到对照组动物体内的肿瘤生长得更快，以及对缺乏特定生物钟基因的小鼠进行的研究显示，某些生物钟基因和某些肿瘤的发生率增加相关，而其他生物钟基因却与之相反。同样，人们对化疗的反应也会随着时间的变化而变化，这就导致了人们期待通过节律化疗（chronochemotherapy）来提高癌症治疗的疗效，同时限制其毒性。然而，与传统的时间化疗相比，时间化疗的临床试验通常没有显示出更好的效果，甚至在患者中引起更差的结局。
2021年1月1日，来自美国北卡罗莱纳大学医学院的Aziz Sancar课题组和来自美国华盛顿大学医学院的Russell N. Van Gelder课题组在Science杂志上合作发表了一篇题为 Clocks, cancer, and chronochemotherapy 的综述，在这篇文章中，作者系统地回顾了生物钟扰乱对人类健康影响的研究现状，特别是在癌症方面，并描述了现阶段通过时辰化疗治疗癌症所获成果及未来努力的方向。
哺乳动物的生物钟在分子水平上由延迟转录-翻译反馈回路（time-delayed transcription-translation feedback loop, TTFL）构成，BMAL1和CLOCK（或其同源NPAS2）构成激活臂，而隐色素（cryptochrome，CRY1和CRY2）和PER（PER1、PER2和PER3）构成TTFL的抑制臂（见下图1）。这种初级TTFL由核受体REV-ERBα和视黄酸受体相关孤儿受体α（RORA）组成的次级环巩固，染色质构象、组蛋白乙酰化和RNA聚合酶II结合的昼夜节律赋予许多基因以昼夜节律。在人类和小鼠中，50%到80%的蛋白质编码基因是由生物钟控制的，其中包括一些对细胞分裂时序至关重要的基因，因此，昼夜节律紊乱可能导致细胞分裂失调，这同样也是癌症的重要标志。
图1. 哺乳动物生物钟调控的分子机制
1昼夜节律紊乱与疾病发生
体内生物钟和外部的地球物理时钟之间的不同步会导致出现至少三种病理状况，分别是时差反应、睡眠相位综合征和代谢综合征。
时差反应的产生是因为核心生物钟振荡器必不可少的生物钟基因的节律性表达无法迅速适应因快速旅行而引起的生物钟相位变化，通常表现出疲倦、易怒、智力减退、睡眠紊乱和胃肠道症状等短暂症状，而一种称为轮班工作障碍的相关疾病也是一种慢性时差反应，长期的昼夜循环和工作时间的不同步会对健康产生更深远的影响。
睡眠相位综合征是指睡眠-觉醒周期相对于明暗周期提前或延迟的情况。家族形式的睡眠相位前移（advanced sleep phase, ASP）和睡眠相位后移（delayed sleep phase, DSP）与核心生物钟基因的多态性相关。人类Per2、Per3、Cry2、Timeless和CK1δ激酶的突变与ASP的遗传形式有关，而DSP主要与Cry1、Per2和Per3的多态性有关。到目前为止，这些研究数据提供了最直接的证据表明生物钟紊乱与人类疾病有关。
代谢综合征的症状主要包括高血糖、高胆固醇和肥胖，从而导致糖尿病、心脏病和中风。流行病学研究表明轮班工作是代谢综合征的重要危险因素，而食物摄入时序被认为是这种关系的基础机制。这些流行病学发现得到了动物研究的支持，即喂食高脂肪食物并允许随意进食的小鼠会出现代谢综合征，而给定进食时间限制的小鼠则不会。
然而，在试图将生物钟功能与生理失调联系起来时，需要注意所有生物钟缺陷动物的表型并非完全对等。例如，Bmal1和clock缺陷小鼠的寿命显著缩短（>15%），而mCry1/2和mPer1/2缺陷小鼠的寿命正常。关于不同的核心生物钟基因具有不同的无效表型可能存在两个解释：首先，作为转录因子，每个昼夜节律蛋白都有可能是非昼夜节律的特定靶点，在突变时会导致明显的多效性；其次，不同敲除引起的改变可能是不同的，例如，Bmal1基因缺失的动物可能会使某种基因处于长期低表达状态，而mCry1/2突变体可能导致相同转录物的高表达。因此，从任何一种生物钟核心基因敲除动物的实验结果中推断出生物钟在所观察到的生理功能障碍中的作用是一项具有挑战性的工作。尽管如此，还是可以得出生物钟与代谢综合征以及相关病理学之间存在一定的机制联系。
2昼夜节律紊乱与癌症发生
2.1流行病学和遗传学研究
世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）2007年的一篇文章提出，夜班工作可能作为致癌因素，尤其对于乳腺癌，该组织在2019年重新评估这一观点，并得出相同结论。然而，其他一些流行病学家却认为夜班或轮班工作引起的昼夜节律紊乱并不会致癌。一些全基因组关联研究已经在为人类生物钟基因多态性影响癌症发病率寻找证据。最近两项meta分析提出乳腺癌与昼夜节律基因NPAS2、CLOCK、RORA、RORB和PER3在统计学意义上的关联性，然而这些等位基因单独产生的相对风险很少大于0.1。值得注意的是，一项对多种肿瘤中生物钟基因的表达和突变进行的大规模系统分析表明，大多数核心生物钟基因在个别肿瘤类型中存在表达失调，个别生物钟基因在特定癌症中发生多重突变，且生物钟基因突变个体的存活率略有下降。虽然这项分析只能确定相关性而非因果关系，但总的来说与假设一致，即特定的昼夜节律紊乱是癌症的一个共同特征，可能有助于理解发病机制。
视交叉上核（suprachiasmatic nuclei, SCN）是哺乳动物所谓的主要昼夜节律起搏器，在SCN受损的小鼠中，格拉斯哥骨肉瘤和胰腺癌异种移植瘤的生长速度均明显加快。此外，其他研究也清楚地显示了昼夜变化与致癌风险的关系。例如，与4:00 p.m.暴露在紫外线下的小鼠相比，4:00 a.m.暴露于紫外线的小鼠，其潜伏期缩短且皮肤癌的多重性增加了大约5倍。
然而，得出一致结论并非那么简单。据报道，Per2基因无效突变使小鼠易患自发和电离辐射（IR）诱发的癌症，这项研究被认为是IARC在其2007年的文章中提出的生物钟扰乱致癌的有力证据。而唯一一项试图重现这一发现的已发表的研究结论是，Per1或Per2基因敲除小鼠的昼夜节律紊乱并不会使动物易患自发性或IR诱发的癌症。此外，还有研究发现其他核心生物钟基因如clock、Bmal1和Cry1/2的无效突变也并非固有致癌基因。Cry1/2-/-基因型延迟了p53-/-小鼠的肿瘤发生，通过促进转化细胞的凋亡将这些动物的寿命延长约50%。而每一组基因突变都会导致小鼠昼夜节律失常，因此，并不能得出普遍性结论，即生物钟缺陷会增加自发性肿瘤的发生率。
2.2生物钟对DNA损伤反应的影响
大多数癌症往往是由DNA损伤引起的。有研究表明，昼夜节律功能的丧失能使组织对DNA损伤诱导的肿瘤形成具有抵抗力，例如纯合子Clock突变通过下调表皮生长因子受体（EGFR）介导的Ras激活，使小鼠对DMBA诱发的皮肤癌产生抵抗力。然而，与野生型小鼠相比，强效的DNA损伤剂二乙基亚硝胺使Cry1/2-/-小鼠胆管癌的特异性增加了8倍。因此，并不能得出一般性结论，即生物钟缺陷会导致致癌DNA损伤效果增强，在不同细胞类型中，DNA损伤剂和生物钟特定成分之间似乎存在着某种特定的关系。生物钟除了在DNA损伤形成水平上发挥作用外，还可能调节DNA修复、DNA损伤检查点以及细胞凋亡和衰老等过程。
DNA修复：在五种DNA修复机制中，包括直接修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、双链断裂或交联修复和错配修复，其中，核苷酸切除修复在昼夜节律相关研究中最为深入。核苷酸切除修复主要用于致癌的紫外线和吸烟造成的DNA损伤，以及抗癌药物顺铂引起的损伤。切除修复活动主要通过两种机制受到生物钟控制，首先，组成性修复因子XPA是由生物钟控制的；其次，单个基因转录的昼夜节律也驱动节律性修复，因为RNA聚合酶II转录的基因的转录链（TS）比非转录链（NTS）优先通过转录偶联修复（TCR）进行修复。因此，小鼠组织中顺铂损伤Pt-d（GpG）的修复受两个昼夜节律程序的控制，一个是总体修复（非转录的DNA和RNA聚合酶II转录基因的NTS），峰值出现在“Zeitbeger time（ZT）”10（~5:00 p.m.），另一个是TS在特定基因转录时的TCR。因此，了解生物钟对与切除修复相关的致癌性的影响是复杂的。
图2. DNA切除修复的昼夜节律控制
DNA损伤检查点：特定的生化途径可以延缓细胞周期的进程，以应对DNA损伤，在形式上定义为细胞周期中的G1-S、intra-S、S-M和G2-M检查点。这些细胞状态的转变是由ATR和ATM损伤敏感的顶端激酶控制的，它们通过效应器激酶激活信号转导通路，使靶蛋白磷酸化，并延缓细胞周期进程，以应对DNA损伤。生物钟通过两种机制影响DNA损伤检查点：（1）通过调节检查点或细胞周期蛋白（包括参与G1-S转换的p20、p21和NONO）的表达；（2）通过生物钟蛋白直接与检查点蛋白相互作用来改变其活性。人类TIMELESS结合CRY2和ATR-ATRIP顶端激酶并调节下游CHK1激酶的活性。以类似的方式，已经证明CRY1也通过与TIMELESS相互作用来调节ATR-ATRIP激酶的活性，并赋予靶蛋白CHK1和p53磷酸化的昼夜模式。值得注意的是，一项研究提出PER1可以通过结合下面两种蛋白参与ATM→CHK2信号通路，并促进CHK2磷酸化，从而促进细胞凋亡。相反，另一项研究表明Per1在肝和胰腺肿瘤中具有抗凋亡作用。因此，这个问题仍有待探讨，并可能再次反映个别生物钟组分的组织特异性功能。
细胞凋亡和衰老：此外，尽管细胞凋亡和衰老这两种途径有着不同的生化机制，但它们在通过细胞死亡或退出细胞周期来阻止癌细胞增殖方面可能发挥着相似的作用。对于凋亡而言，尚未检测到生物钟基因对凋亡的影响；然而在转化细胞中，Cry1/2-/-突变通过增加p53家族成员p73的表达来增强细胞凋亡途径以响应UV或顺铂。对于衰老而言，小鼠Bmal1突变最显著的特征之一是早期衰老表型和寿命缩短。然而，这种效应可能仅仅特定于Bmal1基因，因为当检测Ras转化的Cry1/2-/-细胞的衰老时，未检测到任何影响。
2.3癌基因和抑癌基因与昼夜节律的关联性
生物钟与Myc：c-Myc基因通常在近50%的人类癌症中发生失调。因为E-box序列（CACGTG）是CLOCK-NPAS2-BMAL1复合物的靶点，也是MYC结合位点，因此可以预期控制MYC的细胞增殖和控制昼夜节律的TTFL会存在交集。截至目前，已经确定了几个两者之间的交集：（1）核心生物钟基因似乎调控MYC的表达。CRY2与小鼠磷酸化的MYC结合，招募SCFFBXL3-E3连接酶，促进其泛素化和降解。因此，在缺乏CRY2的情况下，MYC不能泛素化，从而增加淋巴瘤的发病率；（2）MYC似乎可以破坏TTFL，MYC结合Nr1d1 E-box并上调Nr1d1转录。NR1D1蛋白与Bmal1启动子中的ROR元件结合并抑制其转录，从而导致Bmal1下调，引起整体生物钟失调。除了通过MYC→NR1D1→BMAL1引起生物钟失调外，还有研究证明MYC以MYC-MIZ1异二聚体的形式与核心生物钟基因BMAL1和Clock的启动子结合，下调它们的表达，从而破坏生物钟。
MYC失调在淋巴增生性癌症中很常见。在低风险和进展缓慢的慢性淋巴细胞白血病（CLL）中，CRY1的表达被异常的CpG高甲基化所抑制，Cry1启动子的甲基化状态可以作为一个积极的预后指标。而 Clock 和 Bmal1 对急性髓细胞白血病（AML）干细胞的维持是必需的，Clock 和 Bmal1 的下调均能抑制白血病的发生。这些关于CLL和AML的发现揭示了通过抑制负臂（Cry1和Per2）或正臂（Clock和Bmal1）来进行生物钟干扰，可以抑制而不是促进癌变。总的来说，来自MYC和淋巴增殖性癌症研究的数据表明，相同的生物钟成分可能会加速肿瘤的进展或抑制肿瘤的发生，这取决于所涉及的组织或细胞类型和特定的生物钟基因。
图3. 生物钟成分基因与c-Myc癌基因之间的相互作用
生物钟与p53：p53与生物钟之间也有复杂的关系，一项研究发现Per2突变小鼠由于p53蛋白下调而易患IR诱导的癌症，但随后的研究表明无论Per1-/-或Per2-/-突变小鼠都不易患IR诱导的癌症。此外，p53-/-小鼠易患癌症，通常在3个月后发生淋巴瘤或淋巴瘤，出生后6个月内死亡。当p53突变与低外显率的原癌基因突变结合时，死亡率加快，然而，当Cry1/2-/-突变与p53-/-结合时，没有检测到这种效应；相反，p53-/-Cry1/2-/-小鼠的寿命比p53-/-小鼠延长50%，这可以联系Cry1的下调对CLL的影响以及Clock或Bmal1的下调对AML的影响。鉴于这些结果的复杂性，可以得出结论，Cry和Per基因不能归类为一般的肿瘤抑制因子，另外，就像MYC的情况一样，生物钟可以影响癌基因，反过来癌基因也可以影响生物钟功能。p53通过与Per2启动子中E-box重叠的p53反应元件对Per2转录的影响来调节生物钟。因此，p53-/-小鼠对光脉冲存在周期短以及异常的相移反应，以及昼夜节律不稳定的情况。
生物钟与Ras：在一个用于研究昼夜节律紊乱-癌症联系的创新模型中，K-ras和p53在肺部局部缺失，且小鼠受到慢性时差或Per2或Bmal1突变的影响。在这些条件下，肿瘤的发生率和进展速度均发生小幅增长，生物钟基因扰动导致c-MYC表达增加，细胞增殖增强。与MYC和p53一样，Ras也可以调节昼夜节律，即Ras在野生型细胞中的过度表达导致昼夜节律延长和细胞衰老。
3时辰化疗chronochemotherapy
时辰化疗是指在生理节律的适当阶段给药，以达到最佳疗效。采用这种方法主要是由于：（1）一种药剂的功效可能随着一天中的时间而变化，这取决于它的作用机制；（2）药物的药代动力学和代谢可能随昼夜节律变化；（3）药剂的毒性也可能随一天的时间而变化。尽管时辰疗法已经在某些病理条件下开展临床应用，如哮喘、高血压和心血管疾病，但还未产生足够一致性的结论来证明用于癌症治疗是可行的。在一项声称时辰化疗对卵巢癌有实质性效果的小型研究中观察到的结果并没有在随后的更大的研究中得以重现。同样，欧洲一项关于大肠癌时辰化疗的研究提出“研究人群的时间疗法总体上没有任何增益效果”，然而，与传统治疗方案相比，能够发现对男性存在明显有利的趋势，但接受此疗法的妇女死亡率增加了38%。这一疗法可能对特定人群有害这一事实是一个重要发现，在未来实验设计中要多加考虑。
总的来说，现有数据并不支持时辰疗法对任何形式的癌症治疗存在增益效果。为了实现这种方法在癌症治疗中的潜力，需要一种完善的基于机制的方案，能协调特定药物靶点的最佳昼夜节律、药物的有效性和代谢以及药物毒性。对于临床应用，除了考虑正常组织基因组的昼夜修复模式外，还需要特定癌症组织基因组的高分辨率修复图谱来确定优先杀死癌细胞的最佳时机。确定肿瘤与正常组织之间的昼夜节律关系对于开发真正有效的时辰疗法而言至关重要，而实现这一目标的一个主要挑战是开发非侵入性方法来评估癌症的昼夜节律参数。
4结论和展望
肿瘤的发生明显受到昼夜节律机制的影响，但生物钟基因是一般肿瘤抑制因子的假说并不成立。确切地说，特定肿瘤及其潜在机制受到特定生物钟基因功能的不同影响。相反，特定的癌基因可能导致肿瘤的昼夜节律紊乱，肿瘤中失调的生物钟的致病意义也尚未完全了解。DNA核苷酸切除修复的昼夜节律控制的例子说明了在临床上利用生物钟和癌症之间的相互作用的挑战，因为每个基因对DNA损伤的昼夜易感性阶段根据其潜在的转录节律而不同。虽然时辰疗法的概念很吸引人，但生物钟-癌症相互作用的复杂性使得预测给药时间十分具有挑战性。随着化疗药物特异性的增加，通过了解生物钟机制与治疗靶点之间的特定相互作用，也能够更好地理解和优化给药的昼夜效应。
原文链接：
https://science.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.abb0738
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