多铁载体系统中，只有一种与其毒力相关

作者：邵正英，南京农业大学博士在读。主要研究铁载体介导的根际细菌互作。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍鲍氏不动杆菌毒性机制研究，原文于2020年发表在PLOS PATHOGENS。

摘要

鲍氏不动杆菌是一类对人类具有高度威胁的病原菌，而铁素竞争又是病原菌在宿主体内生存、致病的关键。因此本文选用了一株可以产生多种不同铁载体的鲍氏不动杆菌，探究不同铁载体吸收铁素对其毒力的影响。本文首先发现过量的铁会抑制细菌铁载体的整体产生，而限铁会诱导铁载体相关位点会一致上调。此外，扰乱所有的铁载体合成途径才能大幅度减少铁载体产量，这表明铁载体之间存在高度的功能冗余。进一步试验发现，只有Acinetobactin的缺失才会严重影响菌株在寄主体内的定殖，其他两种铁载体的缺失无显著影响，说明Acinetobactin是鲍氏不动杆菌在寄主体内获取铁素的关键铁载体，与病原菌生存、毒力密切相关。

背景

鲍氏不动杆菌致病部分原因是其具有有效竞争金属元素的能力。而在宿主体内，由于生理条件的限制，游离铁离子含量很低，并且宿主会对病原菌实施营养免疫，因此铁素获取对于病原菌而言十分重要，依靠铁载体吸收铁素对于病原菌毒力也十分关键。在以往的研究中往往针对只分泌一种铁载体的菌株，并评估其对整体毒力的影响，结果并不全面。因此，本文选用了一株可以产生三种不同铁载体（acinetobactin，baumannoferrins，fimsbactins）的鲍氏不动杆菌，探究不同铁载体吸收铁素对其毒力的影响。

限铁条件诱导铁载体相关基因的表达和产量的提升

首先将野生型鲍氏不动杆菌ATCC 17978分别培养在外源添加铁的补铁或缺铁的培养基中，对其基因表达进行检测。结果发现三个铁载体基因位点的合成、运输、调节相关基因较补铁培养基中都有所上调（图1），并且进一步观察发现缺铁可以促进整体铁载体的产生，而过量铁则会抑制铁载体的产生。

图1  铁载体生物合成和运输基因在缺铁条件下上调

野生型菌株分别培养在金属螯合的限铁培养基和外源添加铁离子的补铁培养基中，分别提取RNA进行qRT-PCR，分别比较了菌株在限铁培养、富铁培养下4 h(A)和12 h(B)铁载体相关基因变化。

铁载体基因具有功能冗余性

为检测每一条铁载体合成途径对菌株生长的影响，分别对三种途径单独失活的突变株acinetobactin(ΔbasG)、baumannoferrin (ΔbfnL)、fimsbactins (ΔfbsE)进行产量检测，结果发现失活其中一种并不会很大影响总体铁载体的活性（图2A），说明菌株铁载体的功能冗余。

为了继续确定每一种铁载体对菌株获取铁素的影响，分别对应制作双突变体，分别为仅保留acinetobactin的ΔbfnL fbsE，仅保留baumannoferrin的ΔbasG fbsE，和仅保留fimsbactins的ΔbasG bfnL。分别测定其铁载体产量，结果发现三种铁载体途径全部缺失会严重降低产量（图2B），说明这三种铁载体在菌株获取铁素中占据比较重要的地位，而其它双突变体并没有影响整体的产量，说明单独一种铁载体也足以满足菌株对铁素的获取，再一次说明了铁载体的功能冗余。

图2  不同铁载体突变株铁载体产量

Acinetobactin是维持病原菌在宿主体内最大生长量所必需的

虽然铁载体单独缺失的突变株在添加游离铁离子的培养基中生长没有受到显著影响，但由于宿主体内没有足够的游离铁离子，其无法代表宿主体内的环境。因此，作者继续将不同铁载体合成缺失的突变株分别在添加人类血清中或添加人类转铁蛋白的限铁培养基中培养。结果发现Acinetobactin缺失导致菌株最大生长量降低，而其他两种突变株基本没有影响（图3），说明缺失Acinetobactin会降低菌株对宿主铁素的获得，抑制菌株生长。

图3  Acinetobactin突变体在铁限制下生长受损

鲍氏不动杆菌野生型和单一突变株分别培养在添加20%人类血清(A)、180 mg/L人类转铁蛋白(B)、不额外添加铁源(C)和添加30 μMFeCl₃(D)的限铁cTMS培养基中，并测定其OD₆₀₀表示生物量

单独缺失Acinetobactin会影响菌株在这类环境中铁素的获取，那么其他铁载体是否具有这类作用？于是分别保留一种或一种铁载体途径都不保留，查看在血清中的生长情况。结果发现，不同双突变体均可以生长，但都受到抑制，而三条途径都缺失的菌株几乎无法生长（图4），说明这三条铁载体是菌株获取铁素主要途径，对于细胞生长十分关键。

图4  鲍氏不动杆菌在只有人血清和转铁蛋白作为铁源时必须需要铁载体来支持生长

鲍氏不动杆菌野生型以及双铁载体缺失突变株以及三种铁载体突变株分别培养在添加20%人类血清(A)、180 mg/L人类转铁蛋白(B)、不额外添加铁源(C)和添加30 μMFeCl₃(D)的限铁cTMS培养基中，并测定其OD₆₀₀表示生物量。

Acinetobactin对于病原菌在宿主体内增殖与存活是必需的

最后利用鲍氏不动杆菌感染小鼠，探究铁载体在宿主体内的作用，结果表明鲍氏不动杆菌的三种铁载体相关基因在小鼠模型中都有所上升，说明了宿主体内的限铁环境。为进一步探究不同铁载体对鲍氏不动杆菌的毒力贡献，作者分别将缺失一种或多种铁载体合成的突变株感染小鼠。结果发现，只有缺失Acinetobactin铁载体的突变株生长受到了严重抑制，而其它铁载体，虽然在血清培养中能够维持生长，但是在小鼠模型中还是无法支持菌株的生长（图5），说明Acinetobactin是鲍氏不动杆菌在小鼠体内，获取铁素和毒力所必需的。

图5  Acinetobactin生物合成突变体在宿主内的生存和增殖被严重削弱

分别利用鲍氏不动杆菌的野生型（WT）和不同铁载体突变体感染小鼠。24 h后取小鼠肾脏、心脏、肝脏、脾脏、肺和血液，检测活细胞计数。

结论

本文研究发现虽然鲍氏不动杆菌可产生多种铁载体，但只有Acinetobactin对于鲍氏不动杆菌在宿主体内铁的获取是必不可少的，其他两种铁载体则可有可无。对于病原菌而言，拥有多种结构不同的铁载体有利于其生存，可避免其他菌株的铁载体私有化、提高竞争能力和促进不同条件下的铁素吸收，不同的铁载体可能会发挥不同作用，与毒力的关系也不尽相同。

论文信息

原名：Acinetobacter baumannii can use multiple siderophores foriron acquisition, but only acinetobactin is required for virulence

译名：鲍氏不动杆菌拥有多种铁载体吸收铁素，但只有其中一种与其毒力相关

期刊：PLOS Pathogens

IF₂₀₂₀：6.218

发表时间：2020.10

通讯作者：Eric P. Skaar

通讯作者单位：范德堡大学医学中心