稳转细胞系构建常见问题汇总

　　筛选之前需确定G418浓度

　　由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1 g 的粉剂中有效的G418含量大约为0.722 g。G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3'磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

　　汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%。

　　G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体为：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100 ug/ml~1 mg/ml 的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

　　加药时间和维持浓度

　　由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200 ug/ml。

　　其次是加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。

　　筛选时的培养液

　　加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：

　　1. 死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡，因此要及时换液。

　　2. 孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。

　　单化后的鉴定

　　稳定转染细胞，通过PCR鉴定，发现目的基因并不上调，瞬时转染表达是增高的。原因：瞬转是在强启动子下，稳转时你得到的细胞株可能失去了此启动子，或者是改变了细胞的生理特性!用WB和瞬转对照鉴定一下！

　　转染后质粒整合到基因组是随机的，一般两月后（传代10代以上）还表达你想要蛋白的单可以认为是整合了质粒的。