改进+创新：双管齐下提高CAR-T疗法可及性
引言
随着中国NMPA对首个产品的批准上市（参见《中国首个CAR-T获批上市 复星凯特阿基仑赛一石激起千层浪》），CAR-T疗法在国内引起了前所未有的关注热度。这种革命性的肿瘤治疗手段在为患者带来突破性的临床获益的同时，也伴随着一些尚未解决的问题。
上周发布的CAR-T系列文章【价格篇】（参见《当肿瘤患者遇上天价希望——120万的CAR-T疗法能否“降降温”》）中，我们探讨了天价CAR-T疗法背后的原因，以及可能的解决方案。其中，通过生产改进、降低制备失败率以及通过技术创新、开发通用型乃至即用型CAR-T都是目前研究的方向，而且已取得了一些进展。据此，我们将进入今天的CAR-T系列文章——【制备篇】。
CAR-T！
现状：自体CAR-T制备耗时、失败率高
目前全球获批的5款CAR-T疗法全部为自体（autologous）CAR-T细胞，作为原材料的T细胞是从患者自身的体内提取分离出来的，治疗过程通常包括以下步骤：
从患者身上取T细胞：通过白细胞分离术收集患者外周血单个核细胞（PBMC），再分离出特定的T细胞亚群
对T细胞进行改造：通过基因工程对T细胞进行活化、转导、扩增、纯化，最终产生几亿数量级装载CAR基因的T细胞，此时的T细胞类似于精确制导炸弹，在CAR的带领下随时准备找到并杀死肿瘤细胞
CAR-T细胞回输患者：在此之前需要对实验室水平的细胞进行产品制剂，并通过质量检测后放行，经过严格的质量控制后才能最终回输患者
从最初的细胞分离，到最后的制剂回输，整个生产周期一般需要2-4周，甚至更长。在相对漫长的等待时间里，肿瘤患者随时可能出现疾病进展。
此外，由于多数肿瘤患者在进行CAR-T治疗前已经接受过多种治疗方案，体内有功能的T细胞数量很少甚至不存在，这就导致自体CAR-T细胞生产效率低下。根据细胞的个体差异、细胞数量以及细胞质量等原因，CAR-T生产会有2%-14%的失败率。
CAR-T！
生产改进：全流程解决方案降低失败率
CAR-T疗法的高度个性化特质导致了标准化、规模化生产的难度非常高。由于每一份CAR-T产品生产的T细胞原材料来源于每一位不同肿瘤患者，面对如此具有高度异质性的血液样本，想要实现高效率的CAR-T细胞制备，就必须对生产过程的各个环节进行最大程度的优化以及质量控制。
目前为止，工业界仍然没有形成一个成熟的、完全可被接受的CAR-T生产工艺过程。2019年发表在国际细胞与基因治疗学会（ISCT）官方期刊Cytotherapy的文章综述了当前和新型CAR-T细胞生产工艺方法及所需的质量控制系统，有助于系统性梳理CAR-T生产改进的全流程解决方案，帮助CAR-T生产商建立可重复性高质量临床CAR-T细胞生产体系。
细胞分离：封闭式、自动化处理系统
在细胞分离过程中要得到尽可能多的T细胞，同时还要去掉对后续生产有影响的“杂质”，包括红细胞、粒细胞、血小板等。此外，细胞治疗终产品是无法通过过滤进行灭菌的，操作过程中一旦出现污染将是难以挽救的。因此，相比传统手工、开放式的细胞处理方法，采用封闭式、自动化的系统已经成为行业共识，不仅可有效缩短处理时间，还能保证结果的稳定性，此外还避免了污染。
来源：Molecular Therapy
细胞激活：抗体偶联磁珠提供刺激信号
在体内，天然的T细胞能通过树突状细胞等自体抗原呈递细胞表面的主要组织相容复合物与T细胞受体（TCR）结合以及共刺激分子CD3和CD28等进行刺激增殖和活化。然而，树突状细胞的体外效力因患者而异，而且需要复杂的共培养，难以作为T细胞激活的可靠来源，因此研究者们尝试使用了许多方法来模拟天然T细胞的活化。
目前使用较广泛的是CD3/CD28抗体偶联磁珠。在免疫磁珠的作用下特定的T细胞亚群被分离富集，并得到活化和扩增所需的初级和共刺激信号。CD3/CD28磁珠仅细胞尺寸大小，能够使用电磁铁去除。
来源：赛默飞世尔科技，Dynabeads
细胞转导：高成本效益的慢病毒载体
顾名思义，CAR-T制备的核心技术就是实现CAR在T细胞上的表达，需要利用载体来实现这一步。目前有多种可供利用的载体，包括病毒及非病毒。已上市的5款CAR-T产品采用的全都是病毒载体转导的方式，其中吉利德/凯特的Yescarta和Tecartus使用的是γ-逆转录病毒载体，而诺华的Kymriah以及BMS/新基/巨诺的Breyanzi和Abecma使用的则是慢病毒载体，后者可以相对简单地达到所需的滴度以及获得单个整合元件。以Oxford为诺华Kymriah代工的慢病毒制造流程为例，上游工艺主要包括细胞培养和病毒包装，而下游工艺一般涉及澄清、纯化、过滤、浓缩、除菌等步骤，制备一般需要2周。
来源：Molecular Therapy
虽然自体CAR-T产品需要“个体化”的来源和应用，但是编码CAR的病毒载体却是可以大量生产和长期储存的。目前慢病毒载体主要存在的挑战包括了成本高、收率低、活性容易丧失等。高效、稳定的生产工艺是CAR-T生产商的重大受制因素，目前全球仅有少数几家企业具有规模化生产能力和资质。作为CAR-T制备中的核心技术工艺、关键限速步骤及定价居高不下的主要原因，高成本效益的慢病毒载体生产对CAR-T的成功商业化至关重要。
细胞扩增：自动化设备、无血清培养基
基因转导获得稳定的CAR-T细胞之后，想要达到治疗所需剂量，就必须要进行大规模的体外扩增，这也是CAR-T疗法的关键挑战之一。目前主要的扩增方式是利用摇摆式生物反应器进行培养，若能改用自动化设备，则能大大减少人为操作。除此之外，细胞扩增环节的优化还可以通过使用无血清培养基代替传统的人血清培养基，在扩增水平相当的前提下，能有效降低成本及外源物质污染风险。
来源：Molecular Therapy
CAR-T！
技术创新：异基因CAR-T实现“现货供应”
异基因（allogeneic）CAR-T也称同种异体CAR-T，不同于自体CAR-T，作为原材料的T细胞是来自同种异体而非患者自身，通常情况下是从健康供者体内收集或直接使用干细胞来源的T细胞。异基因CAR-T的使用可以简化细胞制备过程，允许创建通用型甚至即用型产品，因此也被称为“现货（off-the-shelf）”CAR-T。如果能实现“现货供应”的概念，CAR-T产品将会更接近一般药品，促进更快速和更便宜的治疗。
然而，目前是否就能够认为异基因CAR-T要比自体CAR-T更具有优势呢？答案是否定的。今年初发表在Nature Reviews Clinical Oncology的文章带来了7例儿童和14例成人急性淋巴细胞白血病（ALL）患者接受异基因CAR-T治疗的临床试验结果，无论是从总缓解率和生存率等疗效相关数据、还是从细胞体内扩增和可检测性、或者从不良事件发生概率来看，异基因CAR-T都不如自体CAR-T。这是因为，异基因CAR-T也存在一些尚未解决的问题，还有待进一步的发展。
目前问题：免疫排斥反应、疗效持久性
免疫排斥反应是器官移植失败的主要因素之一，其发生原因主要是受体和移植物的人类白细胞抗原（HLA）不同。异基因CAR-T是异体来源的细胞，也会面临同样的问题。一旦发生免疫排斥反应，异基因CAR-T就可能被患者自身的免疫细胞清除，使其无法发挥作用。HLA不相容性还可能导致移植物抗宿主病（GVHD），严重时可能危及生命。因此，使用异基因CAR-T治疗时，要对供体特异性抗HLA（DSA）抗体进行评估。近年来快速发展的基因编辑技术可以实现HLA基因的定向敲除，限制免疫排斥反应的发生，同时还能实现CAR-T细胞功能的增强。
来源：Human Vaccines & Immunotherapeutics
CAR-T细胞需要在人体内大量增殖后才可以达到很好的杀灭作用，但由于目前尚不明确宿主自身因素对细胞扩增的影响，异基因CAR-T细胞能否有同样增殖效果尚未可知。除了前面提到过的通过删除HLA分子减少免疫排斥、提高免疫活性，基因编辑还可以通过给予CAR-T细胞更多的共刺激信号从而延长其作用持续时间。此外，增加疗程可以维持足够数量的CAR-T细胞，并取得巩固治疗。
百舸争流：期待首个到达胜利彼岸的选手
目前已有多家致力于开发异基因CAR-T疗法的公司，其中多项已进入临床试验，用于治疗多种血液恶性肿瘤和实体瘤。
国内目前也有不少公司已经布局异基因CAR-T疗法，例如亘喜生物、邦耀生物、北恒生物、隆耀生物、克睿基因、茂行生物、森朗生物等。以致力发现和开发突破性细胞疗法的亘喜为例，候选产品GC027和GC007g分别靶向CD7和CD19，用于治疗T和B细胞ALL。GC027正在进行研究者发起的临床试验（IIT），GC007g已完成IIT获得了安全性和潜在有效性的早期证据，在此基础上开展的1/2期注册性研究正在进行。
结语
祸兮福之所倚、福兮祸之所伏，老子这句阐述“福”与“祸”辩证关系的话，是中国人思想体系中的重要哲学思想。在CAR-T产品的制备竞赛中，这种朴素的辩证思想也得到了充分体现。作为一种新型复杂生物制品，CAR-T生产的难度高、成本大，工艺优化和质量控制是目前CAR-T开发者共同面临的挑战和困难。但是另一方面，复杂的生产工艺也铸就了CAR-T疗法的高技术壁垒，谁能率先解决行业普遍面临的难点，就能最先、最大化地实现商业化的成功。
目前，CAR-T开发者们已经从生产改进和技术创新的角度做了很多工作，而且已经取得了一些可喜的进展。
包括CAR-T在内的基因治疗和细胞治疗，已经彻底改变了一些恶性肿瘤的治疗模式，也是目前最有希望攻克恶性肿瘤的疗法这一。期待随着开发的持续进展，CAR-T疗法可以越来越方便地用于患者治疗、可以逐渐降低生产成本，从而提高治疗的可及性，形成更加美好的恶性肿瘤治疗格局。
CAR-T疗法专栏
*中国首个CAR-T获批上市 复星凯特阿基仑赛一石激起千层浪
*当肿瘤患者遇上天价希望——120万的CAR-T疗法能否“降降温”改进+创新：双管齐下提高CAR-T疗法可及性
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