[文献速递]甲旁亢正义者联盟：Klotho协同CaSR，抑制PTH合成及甲状旁腺增生

研究背景

继发性甲旁亢是CKD的严重并发症，矿物质代谢失衡和甲状旁腺增生在疾病进程中互为促发因素，CKD患者的继发性甲旁亢可能会造成肾性骨营养不良、异位钙化、骨矿化受损，以及心血管事件等严重后果。目前的治疗方案是以维生素D类似物、拟钙剂、磷结合剂等药物治疗平衡失衡的代谢因子，或手术切除过度增生的甲状旁腺。但更深层次的理解甲状旁腺增大的病因机制对临床治疗意义重大。

健康人群中，甲状旁腺通过钙敏感受体感知血钙浓度，在低钙水平时分泌PTH以保持稳态。PTH的分泌会升高血清Ca, Vitamin D, 及FGF23，进而反馈抑制PTH的表达和产生，形成完整的PTH负反馈通路，以维持正常的稳态。

其中，FGF23可激活Klotho-FGFR1复合物，作用于近曲小管中的钠-磷共转运因子进而调控磷稳态；通过影响Vitamin D代谢酶来抑制1,25(OH)2D3的合成；抑制PTH mRNA的转录及PTH分泌，而在低血钙情况下招募Na+, K+-ATP酶来刺激PTH分泌。

研究者希望确定Klotho如何在甲状旁腺中组织特异性地调控PTH和血钙稳态，并探寻在对PTH和甲状旁腺增生的调控中，Klotho与CaSR的相互作用关系。

研究方法

转基因动物模型：研究人员分别组织特异性地敲除了小鼠甲状旁腺中的Klotho、CaSR、以及Klotho/ CaSR。其中，Klotho基因的两个等位基因全部被敲除，在本文中简称为Klothofl/fl，而因CaSR的生理功能必不可少，等位基因全敲除会造成小鼠存活时间过短，因此分别制作了敲除两个和其中一个等位基因的小鼠模型，分别简称为CaSRfl/fl,及CaSRfl/+

引入荧光报告基因测量甲状旁腺体积

免疫共沉淀确定Klotho与CaSR的相互作用

研究结果

等位基因敲除小鼠的指标变化

十日龄的Klothofl/fl小鼠几乎无改变，而十日龄的CaSRfl/fl小鼠发生了包括生存指标，PTH等生化指标和甲状旁腺增生等多项指标的显著改变，同时敲除Klotho和CaSR会进一步放大这些效应。

慢性低钙条件下，Klotho及CaSR对PTH分泌和腺体增生的调控

  • 3周低钙饮食导致了小鼠Ca,P水平的降低及PTH的上调，对照组小鼠PTH增加7倍，但敲除Klotho 或 CaSR的小鼠，PTH只增加了2倍。然而，双敲除小鼠中PTH的水平最高，双敲除小鼠出现PTH的异常分泌。免疫染色显示，双敲除小鼠出现结节及PTH过量分泌。

  • 离体实验（剥离模型小鼠的甲状旁腺体外培养）显示，在无其他因子干预下，klotho敲除小鼠PTH表达量最高

  • 慢性低钙条件下，三种模型小鼠都出现了甲状旁腺增生，其中klotho敲除小鼠的增生最显著。且实验证实，腺体增生主要由细胞增殖造成，基因敲除诱发了细胞增殖，但并未影响细胞凋亡。

甲状旁腺中，Klotho及CaSR的相互作用

  • 十日龄的模型小鼠中，Klotho敲除小鼠出现了CaSR的mRNA及蛋白表达的降低趋势；CaSR敲除小鼠出现了Klotho的mRNA及蛋白表达的显著降低，提示二者存在相互作用。

  • 为了排除CaSR敲除可能导致的血钙水平升高对Klotho表达的影响，研究者通过剥离甲状旁腺离体培养，确认了不同的钙浓度培养条件并不会影响Klotho的基因表达。因而证实Klotho的基因表达下调确实是由CaSR敲除造成，且该下调作用与血钙浓度不相关。

  • 研究者进一步研究了六周龄小鼠中的情况， 与十日龄小鼠的情况类似， 敲除CaSR后Klotho表达量显著降低，同时，敲除Klotho后PTG中CaSR的表达量也显著降低。Klotho缺失时血清PTH水平出现上调，同时合并敲除CaSR后，PTH进一步出现上调趋势，证实二者在调控PTH合成中存在协同作用。

  • 免疫共沉淀证实了Klotho及CaSR存在相互作用, 免疫染色显示二者在胞内的定位存在重叠。

研究总结

  • 研究者证实了，特异性地敲除甲状旁腺中的CaSR会导致血清PTH水平升高及甲状旁腺增生，而若同时敲除甲状旁腺中的Klotho基因则会进一步放大该效应，提示在CaSR缺失的情况下，Klotho在抑制PTH的生物合成和PTG的生长中扮演重要角色。

  • 同时，研究证实，在慢性低钙条件下，Klotho可以独立抑制PTH的产生和甲状旁腺细胞的增殖，提示Klotho在甲状旁腺的增生或继发性甲旁亢的调控中起到重要作用。

  • 该研究同时证实Klotho和CaSR存在相互作用，但分子生物学机制尚不清晰，仍亟需后续的深入研究。

  • 本研究的结果提示了以Klotho作为分子靶标的治疗前景，研究者有望通过上调或激活Klotho来将PTH水平控制在理想范围内，或实现抑制甲状旁腺的过度增生。

参考文献：Fan Y, Liu W, Bi R, et al.  Interrelated role of Klotho and calcium-sensing receptor in parathyroid hormone synthesis and parathyroid hyperplasia[J].  Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2018, 115(16):201717754.

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