基因敲除小鼠制作的基本流程

(一)基因打靶载体的构建

基因打靶载体的基本结构：中间为正筛选基因和相关序列，左右分别为长短同源臂以及在长同源臂外为负筛选基因。设计载体时，需要在打靶位点两侧分别设计一段大小为几kb长度的同源臂，用于同源重组。大家普遍认为同源臂越长，重组效率越高。不过，也有研究用不到1kb的同源臂完成实验，而同时也有研究证实同源臂长度超过8kb后对于同源重组效率的提高就不再有明显的提高作用。同源重组效率最主要还是由目标位点和打靶基因周围序列决定的，所以研究者现在普遍采用一长一短的适中长度同源臂设计方式，便于后期用PCR进行筛选以及最终的DNA印迹(southern blotting)检测确认打靶是否成功。短同源臂长度为2～3kb，而长同源臂为4～6kb。

(二)ES细胞基因打靶和中靶克隆的筛选

目前使用的小鼠ES细胞主要来源于129、 C57BL/6和BALB/c背景的小鼠。研究者们将同源重组应用到ES细胞中从而获得了定点基因修饰的目的，通过将DNA片段导入细胞中，利用片段上的宿主细胞同源臂进行同源重组，将目的基因置换插入细胞基因组中整合表达。在ES细胞中进行同源重组需要将打靶载体进行线性化后，通过诸如电转染(electroporation)、核转染等手段导入细胞中，研究已经证明线性化载体更有利于同源重组的发生。

目前，基因打靶事件的确定通常是首先用PCR反应筛选中靶的ES细胞克隆。PCR引物的设计原则是一个引物位于同源臂外，另一个引物位于载体内。用PCR扩增同源臂短臂，成功的基因打靶克隆会有扩增产物出现。阳性克隆还需要Southem  blotting分析进一步验证。确定正确后，用于下一步的ES细胞显微注射，一体以产生嵌合体小鼠。

(三)ES细胞克隆的胚胎显微注射和胚眙移植

筛选得到的中靶细胞通过显微注射的方式注入到囊胚期胚胎的囊胚腔中，然后将囊胚移植到如假孕母鼠体内，从而产生子代嵌合小鼠。

(四)基因敲除小鼠培育

嵌合小鼠需与野生型小鼠交配，以实现基因修饰生殖系传递。子代中出现毛色分离，如ES细胞来源129小鼠，其中带129品系背景毛色的为所需小鼠，大约50％的小鼠应该带有修饰的基因。如 ES细胞未能成功嵌合进入生殖细胞(germ line)中，则该基因修饰是不可遗传的，子代小鼠都是野生型小鼠的毛色。基因敲除小鼠需要通过数代自交获得纯合、可遗传的后代，然后用于不同的研究中。