科研 | J. Ethnopharmacol.: 中药平胃散通过调节小鼠肠道菌群组成来缓解慢性结肠炎
编译：茜茜，编辑：小菌菌、江舜尧。
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民族药理学意义：平胃散(PWS)是传统中药中常用的复方，在公元1107年首次被记载，并见于《太平仁爱药方》的方剂中。我们先前已经证实平胃散具有减轻DSS诱导的小鼠慢性溃疡性结肠炎(UC)的作用。
目的：我们旨在检测平胃散是否通过调节肠道菌群组成来保护小鼠免受慢性结肠炎的侵袭。
材料和方法：用2.5%葡聚糖硫酸钠(dextransulfate sodium,DSS)饮用水诱导C57BL/6小鼠慢性结肠炎，实验组中灌胃平胃散(8g/kg)。测定小鼠体重变化、粪便浓度和髓过氧化物酶(MPO)活性。采用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测白细胞介素-17A(IL-17A)和干扰素-γ(IFN-γ)的mRNA水平。16SrRNA测序分析粪便中微生物菌群的变化。此外，还检测了包括occludin在内的肠紧密连接蛋白和血清脂多糖(LPS)水平。
结果：平胃散可减轻DSS诱导的小鼠体重减轻，改善小鼠粪便稠度和MPO活性。治疗后IL-17A和IFN-γ的mRNA水平也明显降低(P<0.05)。平胃散不仅能调节occludin水平，而且还能降低血清LPS水平。进一步表明，DSS诱导的肠道微生物组成和丰富度的变化受到平胃散调控。并且平胃散治疗可显著降低DSS诱导的慢性结肠炎小鼠拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度，而增加厚壁菌门（Firmicuts）丰度。
结论：结合前期研究结果，我们发现平胃散可以调节肠道菌群以缓解溃疡性结肠炎的作用。
论文ID
原名：IPing weisan alleviates chronic colitis in mice by regulating intestinal microbiota Composition
译名：平胃散通过调节小鼠肠道菌群组成来缓解慢性结肠炎
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：3.115
发表时间：2020.2.23
通讯作者：张乃生
作者单位：吉林大学
背景
溃疡性结肠炎(UC)是一种影响人类健康的慢性复发性胃肠道疾病。研究证实，许多因素可以诱发结肠炎的发生。肠道菌群是人体的重要组成部分，肠道菌群与宿主之间存在着相互依存、相互制约的关系。正常情况下，肠道微生物参与宿主消化、养分吸收和免疫调节，保证了微生物和宿主之间的稳定和平衡。然而，肠道微生物的破坏将导致包括UC在内的各种疾病的发生。有研究报道UC患者的生物多样性减少，拟杆菌增加，厚壁菌的比例降低。之前研究表明，IBD伴随着肠道微生物组成丰度变化而导致脂多糖增加，进而使炎症加剧。然而，通过干预肠道微生物菌群可以缓解UC。目前，调节肠道菌群平衡已成为防治UC的新方法和新策略。
实验设计
平胃散配伍组成按照白术、厚朴、陈皮、甘草、生姜和大枣按4：3：2：1：1：1(干重)的比例混合而成，所有中草药成分均购自北京同仁堂，成分提取两次，从两次煎煮中收集的上清液在65°C下用旋转蒸汽真空蒸发至1g/ml (粗提物干重/体积)。采用高效液相色谱法(HPLC)对6种化学物质进行了检测。色谱柱为Syncronis C18(4.6 mm×250 mm，5µm)，流速为1.0 mL/min，苍术内酯III的检测波长为220 nm。流动相为甲醇：水(67：33)；厚朴酚检测波长为294nm，流动相为甲醇：水(78：22)。橙皮苷的检测波长为283 nm。流动相为乙腈-0.1%醋酸水溶液；采用6430二极管阵列检测(DAD)测定了甘草苷、异甘草酸和甘草酸的含量。在220 nm波长处检测到甘草酸，在276 nm波长处检测到甘草酸，在370 nm波长处检测到异甘草酸。
结果
1 平胃散的化学组成
采用高效液相色谱法对平胃散中的主要成分进行检测。具有代表性的色谱图如图1所示。并对6个主要组成成分分（白术、厚朴、陈皮、甘草、生姜和大枣）进行鉴定并定量，如表2所示。
图1：平胃散的高效液相色谱分析。其中 1, 苍术内酯III(Atractylenolide III); 2,厚朴酚(Honokiol); 3, 陈皮苷(Hesperidin); 4,甘草苷(Liquiritin); 5, 异甘草酸(Isoglycyrrhizin); 6, 甘草酸(Glycyrrhizic acid).
2 平胃散对DSS诱导的慢性结肠炎的缓解作用并且抑制MPO活性
实验结果发现，平胃散缓解DSS诱导的慢性结肠炎小鼠体重减轻、血便和腹泻等症状。在这项研究中，小鼠在0、5、12、17和24天的结肠炎症状如图2A所示。与对照组相比，DSS诱导的粪便性状变化(在第24天仍然显著，而服用平胃散后改善了这些变化(图2B)。此外，我们检测了23天和24天的体重变化。结果表明，与对照组相比，DSS组小鼠体重下降，差异显著(P<0.01)。正如所预期的那样，与DSS组相比，平胃散组显著改善了体重减轻(图2C)。
MPO活性测定中性粒细胞浸润到炎症结肠粘膜的数量。MPO的激活是组织中性粒细胞数量的重要标志。在这项研究中，我们取一部分结肠组织称重，用PBS匀浆，取上清液测定其中的MPO的活性。结果表明，DSS可使MPO活性显著升高。然而，与DSS组相比，平胃散显著抑制了DSS诱导的MPO的过度激活(图3)。
图2：.平胃散对DSS诱导的小鼠慢性结肠炎的缓解作用。(A)DSS诱导小鼠在0、5、12、17和24天出现的症状。(B)24天的粪便特性。(C)23天和24天时的体重。数值为Mean±SD。∗∗组与DSS组比较P<0.01，DSS组与对照组比较有显著性差异(P<0.0 5)。
图3.MPO活性的抑制。检测结肠组织中MPO活性。数值为Mean±SD。∗∗组与DSS组比较，P<0.01；#p<0.05，与对照组比较，P<0.05。
3 平胃散抑制IL-17A和IFN-γ水平
先前的研究表明IL-17A和IFN-γ与结肠炎有关。事实上，我们在这项研究中发现，DSS显著增加IL-17A和IFN-γ的基因表达水平。然而，平胃散能显著抑制DSS诱导的IL-17A和IFN-γ的基因表达水平的升高(图4)。
图4.抑制IL-17A和IFN-γ水平。用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测结肠组织中IL-17A和IFN-γ的mRNA水平。
4 肠道生物失调的调控
在16srRNA测序中，剔除不合格序列后，共产生有效序列1323864条，平均每份粪便样本产生66193±17694个高质量的序列。多样性分析表明，DSS组的被观察物种数、Shannon指数、OTU指数、 ACE指数、Chao1指数和PD全树指数均低于对照组。然而，接受平胃散治疗的小鼠的微生物菌群丰度比未治疗的要高(补充图1)。基于UniFrac的主体坐标分析(PCoA)显示了四个处理组的微生物区菌群组成的明显聚集(图5)。为了进一步研究微生物种类以及肠道微生物与平胃散治疗效果之间的关系，我们在微生物门的水平上检测了微生物菌群组成(图6A)(补充表1)。结果表明，DSS处理与对照相比，厚壁菌降低了25.76%，拟杆菌增加了25.29%。但经平胃散处理后，厚壁菌门的相对丰度显著提高。此外，在纲、目和科水平上(图6B)(补充表1)，经DSS处理后，拟杆菌纲、拟杆菌目、拟杆菌科和紫单胞菌科的数量均显着增加。但给予平胃散后，DSS诱导的菌群数量增加明显减少，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。通过热图对肠道微生物进行分析(图7)(补充表1)。DSS处理后，拟杆菌和紫单胞菌的比例显着增加，乳酸杆菌比例显著降低。然而，平胃散处理后显著降低了拟杆菌和紫单胞菌的相对丰度，增加乳酸杆菌的相对丰度。
图5.PCoA分析。每个点代表老鼠的粪便微生物菌群。
图6.DSS诱导小鼠模型在门和科水平上的肠道菌群。(A)按门水平划分的微生物菌群条形图。(B)按科水平划分的微生物菌群条形图
图7热图显示.DSS诱导的肠道菌群在属水平上的改变
5 降低血清LPS浓度
如图所示，DSS处理显著增加血清中的LPS水平。但与DSS组相比，平胃散可显著降低LPS浓度。occludin是一种重要的结肠紧密连接蛋白，在维持肠道通透性方面起着重要的作用，我们进一步用IHC检测了occludin水平。与对照组相比，DSS组的occludin染色强度显著降低。然而，平胃散处理后对DSS诱导的occludin染色强度降低有调节作用。
图8.血清内毒素(LPS)浓度的降低。LAL法测定血清LPS浓度。
图9.occludin蛋白表达的调节。免疫组化(IHC)检测occludin (200×)。阳性染色为棕色。
讨论
中医药已经被开发并建议用于治疗许多疾病。到目前为止，仍然没有有效的治疗方法来治疗溃疡性结肠炎。在我们之前的研究中，我们已经证实平胃散可以保护小鼠免受DSS诱导的慢性结肠炎的影响，能显著改善DSS诱导的小鼠体重变化、大便稠度和MPO活性，降低IL-17A和IFN-γ的基因表达水平。这些结果进一步表明平胃散可能是治疗慢性结肠炎的一种有前途的候选药物。基于上述结果，我们进一步探讨了平胃散治疗例慢性结肠炎的作用机制。肠道微生物组成是人体的重要组成部分。由细菌多样性减少引起的肠道微生物菌群紊乱与很多疾病有关，包括IBD的发病机制。在本研究中，我们发现用α多样性指数分析的细菌多样性在DSS组显著降低。此外，DSS组肠道微生物群落与对照组之间存在聚类距离。然而，平胃散处理加剧了DSS诱导的微生物多样性的下降，平胃散组的微生物群落接近对照组的。这些结果表明，平胃散可以帮助肠道微生物菌群保持其群落和丰富度。
之前有研究微生物菌群的改变与UC的发病或复发有关。发现溃疡性结肠炎中厚壁菌门的丰度较低、乳酸杆菌减少，而变形杆菌增加。并且，IBD的肠道菌群失调可能是肠道炎症的继发性表现。其中，拟杆菌可以改变肠道通透性并诱导慢性全身性炎症，与结肠损伤呈负相关。在本研究中，与DSS组相比，平胃散处理显著降低了拟杆菌的丰度和数量，而提高了厚壁菌的丰度和数量。其中厚壁菌门，多数认为是与健康相关的细菌，而拟杆菌门可能是小鼠结肠炎模型中发病的指示物。在DSS小鼠中拟杆菌和紫单胞菌的水平增加，经平胃散处理后显著减少。这些结果提示平胃散可能通过影响肠道微生物菌群发挥效应。
在本研究中，我们发现甘草酸和陈皮苷是平胃散中的两个主要成分，这与我们之前的研究是一致的。甘草酸是一种具有生物活性的三萜皂甙。有报道称，甘草酸具有抗炎、抗氧化等多种生物活性。此外，最近的研究也表明甘草酸具有调节肠道微生物菌群的作用。陈皮苷是一种黄酮类化合物，属于黄酮类化合物。与其他黄酮类化合物相比，陈皮苷在肠道中的吸收较差，有研究表明陈皮苷可以调节肠道微生物菌群。这些结果进一步表明，平胃散中甘草酸和陈皮苷可能是主要活性成分来调节肠道菌群。
脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌的重要组成部分。研究表明，LPS在IBD患者中明显增加。结果发现，DSS组的LPS浓度明显升高。与DSS组相比，平胃散治疗组血清LPS含量明显降低。血清LPS水平的升高与肠道菌群紊乱和肠粘膜通透性有关。在本研究中，证实了平胃散对肠道菌群的调节作用。因此，我们也初步探讨了平胃散对肠道完整性的影响。肠道屏障是维持肠道完整性的重要组成部分。occludin是一种重要的结肠紧密连接蛋白，在维持肠道通透性方面起着重要的作用。在本研究中，DSS治疗显著降低了occludin的表达，而平胃散对DSS诱导的occludin降低有调节作用。
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