科研 | Gut Microbes：肠道通透性、菌群移位、十二指肠和粪便微生物的变化与人类酒精性肝病进展的关系
编译：莫沉，编辑：小菌菌、江舜尧。
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临床前的动物模型数据表明肠-肝轴在酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)的进展中发挥着重要作用，但目前基于人群队列的研究数据相对较少，尤其是在疾病的早期阶段。本研究纳入了遵循康复计划并匹配健康对照的酒精滥用(alcohol use disorder, AUD)人群，目的在于评估在AUD患者中肠道通透性、十二指肠和粪便微生物和微生物移位之间的关系，以及这些变化与肝脏疾病进展之间的关系。研究者测定了受试者肠道通透性(利用尿液51Cr-EDTA排泄量、粪便中白蛋白含量和十二指肠远端组织活检)、肠上皮损伤(组织病理学、血清iFABP和肠道基因表达水平)和微生物移位(ELISA试剂盒分别检测革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌血清标志物)，利用16S rRNA测序分析十二指肠粘膜相关微生物和粪便微生物。ALD的分期采用FibroScan(肝脏硬度，受控衰减参数)结合血清AST、ALT和CK18-M65。该研究证实了在ALD早期阶段十二指肠粘膜相关微生物结构的改变，以及微生物代谢产物和微生物移位与肝病进展的关系。
论文ID
原名：Intestinal permeability, microbial translocation, changes in duodenal and fecal microbiota, and their associations with alcoholic liver disease progression in humans
译名：肠道通透性、菌群移位、十二指肠和粪便微生物的变化与人类酒精性肝病进展的关系
期刊：Gut Microbes
IF：7.74
发表时间：2020.3
通讯作者：Peter Stärkel
作者单位：比利时鲁汶大学胃肠肝病实验与临床医学研究中心
实验设计
本研究共招募了在2017年4月至2019年1月，106名中年男性酒精滥用患者在专用戒酒病房接受选择性戒酒，遵循高度标准化和受控的3周戒断和康复治疗，所有患者均报告长期(>1年)饮酒(>60g/d)。同时，与性别、年龄和BMI匹配的24名健康志愿者进行比较。这项研究的目的是评估AUD患者的肠道通透性、十二指肠和粪便微生物和菌群移位之间的关系，以及这些变化与肝脏疾病进展之间的关系。通过测量放射性探针51Cr-EDTA在尿液排泄量和ELISA试剂盒测定粪便白蛋白含量来评估肠道通透性的变化，利用ELISA测试患者血清肠脂肪酸结合蛋白，来评估肠上皮细胞损伤状态，同时对受试者十二指肠组织切片进行免疫组化和免疫荧光病理分析。
结果
1 队列研究设计
受试者人群包括106名中年男性AUD患者和24名志愿者。表1总结了本研究纳入的受试者的临床基本数据。所有的受试患者直到入院前一晚都在饮酒，27%的患者(29/106)在第二天入院时检测到血液酒精浓度，中位值为0.5 g/L(范围0.1-2.5 g/L)，实验研究队列见图1。
表1研究纳入的受试者的临床基本数据
图1酒精戒断临床研究的标准化方案。本研究纳入的酒精滥用患者采用高度标准化的临床检查并进行标准化采样。
为了进行与临床参数相关的更详细的分析，我们评估了AUD患者的肝病状态，这些患者的临床分型如表2中所示，分为非进行性(无肝病/单纯性脂肪变性)和进展性肝病(脂肪性肝炎/脂肪纤维化)。所有脂肪性肝炎或脂肪纤维化患者的肝功能均保持完好，无肝功能失代偿的临床体征，多普勒超声排除了肝脏中任何明显的血管或胆道问题。
表2 基于酒精性肝病临床评估的患者亚群特征
2 基于CK18进一步细化临床分型
细胞角蛋白18（Serum cytokeratin 18,CK18）在细胞损伤(坏死或凋亡)时释放，被认为是肝脏特异性细胞损伤的标记物。与健康志愿者相比，AUD患者血清CK18-M65显著升高。在不同的临床亚组中，患有进展性ALD的AUD患者的CK-M65水平较高，而非进展性ALD患者的CK-M65水平则没有显著升高 (图2)。ROC曲线分析表明，血清CK18-M65水平可以较为准确地区分进展性ALD和非进展性肝病。
图2血清细胞角蛋白18(CK18-M65)作为肝损伤的替代标志物。ROC分析表明，血清CK18-M65水平升高是进展性酒精性肝病的显著特征之一，可以区分严重性酒精性肝病与非进展性酒精性肝病。
血清CK18-M65可以作为诊断进展性ALD的可靠工具(表3)。因此，因此，研究者采用CK来调整无肝脏疾病或脂肪变性组(CK18 < 416 U/L, G1组)和脂肪性肝炎或脂肪纤维化组(CK>416 U/L, G2组)的区分。
表3 血清CK18-M65水平作为进展性酒精性肝病生物标志物的统计分析
3 AUD患者肠道通透性、形态学改变和微生物移位的评估
该研究通过放射性探针51Cr-EDTA的尿液排泄和粪便白蛋白含量来评估肠旁细胞和毛细血管渗漏。与对照组相比，51Cr-EDTA和粪便白蛋白含量增加与AUD的肠道渗漏增加相一致(图3a)。由于肠道形态学的变化和肠上皮细胞损伤可能是导致肠道屏障功能障碍的原因，该研究评估了受试者十二指肠活检的粘膜形态，并测量了血清i-FABP水平作为肠上皮细胞损伤的标志。与健康志愿者相比，AUD患者的组织特点是绒毛更短，绒毛蛋白相关基因表达下调（图3b），而AUD患者和对照组之间的血清i-FABP则没有显着变化（图3c）。可溶性CD14 (soluble CD14, sCD14)、脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein, LBP)和肽糖识别蛋白(Peptidoglycan-recognition Proteins, PGRPs)分别被用作革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的菌群移位(microbial translocation, MT)的血清标志物。与健康对照组相比，AUD患者的三项标志物均显著升高(图3d)。此外，长期饮酒也与真菌菌群的改变和真菌相关代谢产物的移位有关。
图3 评估肠道通透性(IP)、十二指肠粘膜形态学特征、肠细胞损伤和菌群移位。(a)酒精滥用人群中，51Cr-EDTA体内评估肠道通透性 (n=86)、尿液排泄量和粪便白蛋白含量(n=78)与对照组(n=14)相比显著增加。(b)健康志愿者和AUD患者十二指肠活检的代表性HE染色。(c)形态计量学分析显示，与对照组(n=5)相比，AUD患者(n=11)的绒毛长度显著缩短，与对照组(n=9)相比，AUD患者(n=43)的绒毛基因表达显著下调；血清肠细胞损伤标志物(肠脂肪酸结合蛋白水平在AUD患者(n=77)和健康人(n=11)之间没有差异。(d)75例AUD患者的革兰氏阴性可溶性CD14(sCD14)、脂多糖结合蛋白(LBP)和革兰氏阳性易位标志物肽聚糖识别蛋白(PGRP)均显著高于对照组(n=15)。
4 少部分AUD患者IP增加并伴有紧密连接和PV-1血管系统表达破坏
本研究中，约三分之二的AUD患者的肠道通透性测量结果与对照组接近，而接近36%-40%的患者基于粪便白蛋白和51Cr-EDTA检测，出现肠道通透性增加(图4a)。肠道通透性增加主要与检测小肠部分(十二指肠、空肠)的 51Cr-EDTA含量有关，而远端肠道部分(回肠、结肠)则没有明显改变。此外，调节细胞旁通透性的紧密连接蛋白 (Zonula Occludens 1, ZO-1)在高肠道渗漏的AUD受试者中被破坏，而在正常肠道通透性的受试者中并未受损 (图4b)。此外，与对照组相比，AUD患者十二指肠质膜囊泡相关蛋白1(plasmalemma Vesicle-Associated Protein 1,PV-1)的表达上调，PV-1是肠-血管屏障破坏的标志(图4c)。
图4 评估肠道通透性与肠道组织病理特征的关系。(a)与对照组相比，只有三分之一的AUD患者的肠道通透性显著增加。(b)健康志愿者十二指肠组织ZO-1的免疫荧光染色，仅在肠道通透性升高的AUD患者中显示紧密连接中断(用箭头表示)。(c)健康志愿者以及不同粪便白蛋白水平的AUD患者十二指肠组织PV-1的免疫荧光染色，定量染色分析显示AUD患者血管PV-1表达增高主要与粪便白蛋白增高有关。
5 微生物的移位不完全依赖于肠道通透性的增加
与健康对照组相比，AUD患者的血清微生物移位标志物(PGRPs、sCD14和LBP)显著升高。然而，无论基于51Cr-EDTA还是粪便白蛋白测量，在肠道通透性增加和正常的患者中，上述水平是一致的(图5a-c)。与细菌易位标志物一样，AUD患者ASCA水平的升高独立于肠道通透性增加和粪白蛋白升高。上述结果表明，在AUD患者中，即使肠道通透性正常，也可能发生全身性微生物移位。
图5 评估血清微生物移位标志物与肠道通透性的关系。通过51Cr-EDTA尿液排泄量(左图)和粪便白蛋白含量测定，肠道通透性高低的AUD患者的革兰氏阴性(a,b)可溶性CD14(sCD14)和脂多糖结合蛋白(LBP)以及(c)革兰氏阳性移位标志物肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan Recognition Proteins, PGRPs)与对照组相比显著增加，而通过测定51Cr-EDTA尿液排泄量(左图)和粪便白蛋白含量(右图)表明，肠道通透性水平不同的AUD患者之间没有差异。
6 AUD患者十二指肠粘膜炎性细胞浸润减少和促炎反应减弱
由于肠道炎症可能导致肠道细胞损伤并有利于微生物移位，研究者对免疫细胞在十二指肠粘膜的浸润进行了量化，并评估了主要肠道相关特异性促炎细胞因子在十二指肠粘膜中的表达。总体而言，在AUD患者的十二指肠远端活检中，CD45阳性的免疫细胞和更具体地说CD68阳性的巨噬细胞和CD3阳性的T细胞减少(图6a-c)。虽然白细胞介素-1β(IL-1β)基因表达增加，但其他肠道特异性促炎细胞因子，白细胞介素17和22，以及干扰素-γ(IFN-γ)与健康对照组相比保持不变(图6d)。上述结果排除了粘膜炎症作为AUD患者形态学改变和微生物移位的重要驱动因素。相反，小肠中免疫效应细胞的减少可能会导致免疫反应的减少，并促进微生物的移位。
图6 酒精滥用患者十二指肠免疫细胞和炎症标志物的检测。CD45(a)免疫组织化学分析显示，AUD患者(n=11)的十二指肠粘膜免疫细胞较对照组(n=6)减少。对巨噬细胞标志物CD68(b)和T细胞标志物CD3(c)的分析显示，酒精滥用者(n=15)十二指肠粘膜中该两种细胞类型均较健康对照组(n=8)减少。酒精滥用者(n=59)十二指肠IL-1β基因表达量(d)高于正常对照组(n=13)，而IL-17、IL-22和IFN-γ的基因表达水平与正常对照组无明显差异。
7 十二指肠粘膜相关微生物和粪便微生物与肠道通透性的关系
接下来，研究者分析了AUD患者十二指肠活检组织中微生物的组成，虽然没有显著差异，但与健康志愿者相比，AUD患者的十二指肠相关微生物具有更多的OTUs，反映了更高的菌群丰富度。值得注意的是，在AUD患者中，细菌数量的增加通常伴随着Simpson指数的降低。这一结果表明，不同的OTUs并不均匀分布，某些细菌分类相较其他菌群类群更具优势(图7a)。虽然PCoA分析(基于加权和未加权的Unifrac算法)不能明显区分AUD患者和健康对照(图7a)，但研究者发现有10个菌属在AUD患者和对照组之间是不同的。LDA分析显示，在AUD患者中，Nubsella, Rothia和Streptococcus的相对丰度较高，而在健康受试者中，Mycobacterium, Alcaligenes, Lachnoclostridium,Ralstonia, Rarobacter, Ethanoligenens,和Dolosigranulum的相对丰度较高(图7b)。接下来研究者继续评估了粘膜相关微生物的改变是否与肠道通透性增加有关。尽管发现AUD患者与健康受试者之间的差异，但与肠道通透性正常的患者相比，肠道通透性增加的AUD患者的α多样性和β多样性没有明显差异(图7c)。上述研究结果表明，十二指肠微生物群落的改变不一定与肠通透性增加有关。
图7 评估十二指肠粘膜相关微生物与肠道通透性(IP)的关系。(a) 微生物a多样性(左)显示，与健康志愿者(n=8)相比，AUD患者(n=22)的OTUs数量显著增加，表明其丰富度增加。细菌数量的增加伴随着均匀性(Simpson指数)的降低；相反，b多样性在AUD患者和对照组之间没有差别。(b) AUD患者和健康人的十二指肠远端存在不同菌属的过度表达，通过对AUD患者进行比较分析，AUD患者和健康人的十二指肠远端存在不同的菌属。(c) 高IP组(n=8)和低IP组(n=14) AUD患者的a多样性无统计学差异。
8 AUD患者粪便菌群的丰富度和均匀度降低与肠道通透性增加相关
研究者评估了AUD患者队列中粪便微生物群落的变化是否与肠道渗漏有关。该研究比较了AUD患者和健康对照组的粪便微生物群，结果发现，AUD患者粪便样本的α多样性指数降低，反映了菌群的丰富度和均匀度有所降低。上述结果也说明，与对照组相比，AUD患者粪便样品中的OTU数量更低且分布更不均匀(图8a)。此外，基于UniFrac指数的PCoA分析可以将AUD患者与健康受试者显著区分开，这表明两组之间的菌群整体结构有显著差异(图8b)。此外，与对照组相比，粪便微生物的丰富度和均匀度的降低主要集中在肠道通透性升高的AUD患者中，而在肠道通透性正常的AUD患者中并没有发现(图8c)。相反，粪便微生物的β多样性在肠道通透性升高和较低时是相似的(图8d)。上述结果表明，粪便微生物的组成变化可能与肠道通透性增加有关。
图8 评估AUD患者粪便微生物与肠道通透性(IP)的关系。(a)与13名健康志愿者(n=13)相比，AUD患者(n=30)的微生物α多样性OTUs数量减少,表明其丰富度有所降低；与对照相比，细菌数量的减少伴随着均匀性的降低，反映了稀有物种的丧失。(2)利用加权和未加权的UniFrac距离算法进行PCoA分析比较，发现AUD患者和对照组的粪便微生物总体组成(b多样性)不同。每个点代表一个样本，样本之间的距离代表样本群落组成的差异。(c)与对照组相比，均匀性降低(Shannon和Simpson)仅在高IP的AUD患者中发现。(d)高IP和低IP的AUD患者粪便微生物组成(β多样性)无明显变化。
9 进展性ALD与肠道通透性、微生物移位的关系
研究表明，在ALD模型中，微生物产物移位的增加与肝病的进展有关。本研究在使用CK18-M65生物标志物对临床亚组进行细化分组后，评估了肠道通透性、微生物移位标志物、十二指肠和粪便微生物的变化是否与肝病的进展有关。51Cr-EDTA在进展性ALD组相较对照组显著升高，但在非进展期ALD组与健康对照组无明显差异。相比之下，粪便白蛋白的增加与ALD的严重程度无关(图9a)。血清革兰氏阴性菌标志物sCD14和LBP在AUD患者中显著上调，其中在进展性ALD患者的水平最高(图9b)，上述两个标记也与CK18-M65显著相关。相比之下，AUD患者的PGRPs升高与肝病的分期无关(图9b)。
图9 肠通透性(IP)、微生物移位与ALD分期的关系。(a)51Cr-EDTA评估的肠道通透性(左侧)随进展性ALD的增加而显著增加，而非进展性ALD的肠道通透性水平仍接近对照组。粪便白蛋白水平(右)与肝病严重程度无关。与对照组相比，非进展性ALD患者的粪便白蛋白水平显著增加。(b)与对照组相比，革兰氏阴性菌血清微生物移位标志物sCD14和脂多糖结合蛋白(LBP)水平逐渐升高，进展期ALD患者血清sCD14和脂多糖结合蛋白(LBP)水平最高，而革兰氏阳性移位标志物PGRPs水平与对照组相比无明显变化。
10 进展性ALD患者十二指肠粘膜相关微生物丰富度增加
伴随进展性ALD的AUD患者表现出丰富度(观察到的物种数，Chao1指数)增加，均匀性降低，优势菌群转向其粘膜相关微生物的某些细菌分类群。而与对照组相比，伴随非进展性肝病的AUD患者则没有发现明显的变化(图10a)。尽管总体细菌结构(β多样性)在各组之间没有显著差异，但研究发现在进展性酒精性肝病和对照组之间有6个OTUs不同。LDA分析表明，在伴有进展性ALD的AUD患者中，Streptococcus, Shuttleworthia,和Rothia的相对丰度显著升高，而Mycobacterium, Alcaligenes,和Deinococcus在健康志愿者中具有特异性(图10b)。最后，该研究还评估了粪便微生物失调是否也与进展性ALD有关。有趣的是，与十二指肠微生物变化形成对比的是，当队列被分成有或没有进行性肝病的AUD患者与对照组时，并没有观察到粪便微生物α多样性和β多样性的差异(图10c)。因此，该研究表明，与进展性ALD相关的是十二指肠粘膜相关微生物特定细菌的丰富度的增加，而不是粪便微生物。
图10 十二指肠粘膜相关微生物和粪便微生物与酒精性肝病严重程度的关联分析。(a)对健康对照(Ctrl)、非进展性ALD患者(G1)和进展性ALD患者(G2)的微生物a多样性分析显示，与对照组相比，G2的微生物丰富度增加，而均匀度降低，其粘膜相关微生物的细菌优势度发生了变化。(b)AUD患者十二指肠远端不同菌属的过度表达与ALD严重程度和健康人(Ctrl)的关系，AUD患者(G1和G2)与对照组相比，在属水平的LDA分析。(c)与十二指肠粘膜相关微生物相比，根据肝病的严重程度进行区分时，急性肝病患者的粪便微生物a多样性没有差异。
11 微生物移位标志物与进展性ALD患者十二指肠微生物变化相关
接下来，该研究评估了微生物变化和微生物移位的两种代表性血清标志物(sCD14和PGRPs)之间的关系。在非进展性ALD患者中，6种十二指肠相关微生物和4种粪便相关微生物与移位标记物sCD14密切相关。相反，与移位标志物相关的十二指肠微生物种类在进展期ALD中进一步增加到12种，与sCD14相关的有5种，与PGRPs相关的有7种。此外，粪便样本中有5种主要与PGRPs相关。所有个体相关性均有统计学意义(p<0.05)。但是，经过多重比较调整后，q值大于0.5(表4)。
表4 酒精性肝病患者不同阶段十二指肠和粪便微生物种类与血清微生物移位标志物sCD14和PGRPs的相关性分析
12 短时间戒断可恢复正常的肠道通透性和粪便微生物，但不能使微生物移位和肝损伤正常化
在缺乏有效的药物治疗的情况下，戒酒是ALD治疗的基础。因此，研究者评估了在AUD患者中短暂的戒酒是否能够恢复酒精引起的肠道紊乱和肝细胞损伤。该研究重新测试了在3周戒断计划(T2)结束时仍保持戒断的AUD患者，伴有尿液中高51Cr-EDTA和粪便高白蛋白的AUD患者的肠道通透性恢复到与对照组接近，而入院时已经正常的患者的肠道通透性仍然较低(T1)(图11a)。与此同时，AUD患者在戒断后血清sCD14水平也显著下降。相比之下，停止饮酒并没有改变LBP和PGRPs(图11b)，表明某些微生物的移位的存在。此外，停止饮酒后血清CK18-M65有所下降(图11c)，但仍显著高于对照组水平，表明肝脏损害仍然持续但相对有所减弱。上述研究间接表明，增加的肠道通透性不是微生物移位发生的绝对必要条件，但仍然维持了细菌移位与肝脏疾病的潜在关联。根据通透性和ALD分期对AUD患者戒断后3周后的粪便微生物组成进行检测。
有趣的是，该研究发现只有肠道通透性显著升高的AUD患者的菌群均匀度(Shannon指数和Simpson指数)有所增加(图11d)，而菌群物种数量则保持不变。而肠道肠通透性正常的AUD患者中，a多样性指数则没有显著变化(图11d)。在ALD分期方面，该研究发现只有AUD患者伴非进展性ALD时，a多样性指数(丰富度和均匀度)略有变化，但进展性ALD没有变化(图11e)。总体而言，在戒断期间，AUD患者的微生物多样性没有显著变化，上述结果支持并强化了粪便菌群失调和肠道渗漏之间可能存在联系的观点，但目前该研究发现与肝脏ALD的进展无关。
图11 短期戒断对肠道通透性、微生物移位、肝脏损伤和微生物组成的影响。(a)尿液中51Cr-EDTA排泄量高、粪便白蛋白含量高的AUD患者，T1时尿液中51Cr-EDTA水平恢复到正常对照组水平，而IP正常或者低IP的AUD患者则无明显变化。(b)在微生物移位标志物中，只有sCD14水平在戒断后有所下降，而LBP和PGRPs水平没有下降。(c) CK18-M65在戒断后显著降低，但仍高于对照组。(d)高肠道通透性的AUD患者戒断后粪便微生物的均匀度增加，但不增加粪便微生物的丰富度，而最初肠道通透性正常的患者的粪便微生物均匀度有所增加。(e)观察到的物种和均匀度在非进展性ALD的AUD患者戒断后仅有轻微的改变，在进展性ALD患者中则没有。
结果
该研究发现，仅有部分AUD患者51Cr-EDTA和粪便中的白蛋白升高，并伴有紧密连接中断和血浆膜囊泡相关蛋白-1的血管表达，而肠通透性的增加与十二指肠微生物结构的改变或肠上皮的改变无关，而是与粪便微生物的组成改变有关。单纯的肠漏并不能解释AUD患者微生物移位增加的原因。相反，伴有进展性ALD(脂肪性肝炎、脂肪性纤维化)的AUD人群的特点是十二指肠菌群失调，优势转移到特定的潜在致病菌属(Streptococcus,Shuttleworthia, Rothia)，肠道通透性增加，微生物移位相关标志物升高。
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