科研 | 氧化三甲胺的多组学关联研究
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氧化三甲胺（TMAO）与动脉粥样硬化和心血管疾病（CVD）的发生发展密切相关。本研究通过分析血液中TMAO含量与血液标志物、代谢产物、蛋白标志物、肠道微生物以及饮食和疾病的相关性，发现肾脏标志物、CVD相关蛋白、肠道微生物代谢产物、饮食相关微生物模式均与TMAO水平有关。TMAO的积累以及促进动脉粥样硬化等疾病的机制，可能是饮食与肠道微生物以及一系列系统性因素复杂互作的结果。
示意图
论文ID
原名：A Multi-omic Association Study of Trimethylamine N-Oxide
译名：氧化三甲胺的多组学关联研究
期刊：Cell Reports
IF：8.032
发表时间：2018.7
通信作者：Ohad Manor
通信作者单位：Aruvale生物科技有限公司（美国）
实验内容
1. 实验内容及检测指标
纳入648名受试者，其中52%为女性，75%为白人，平均年龄50±13岁，平均体质指数（BMI）为26±5.4，肾小球过滤比率（GFR）为89±16 mL/min/1.73m2，平均血尿素氮（BUN）与肌酸酐比例为18±4.4。每名受试者在试验开始，即基线时取血液样本检测918种生物标记物，包括71项临床指标、619种代谢产物和228种蛋白。此外，收集受试者粪便样本进行16s高通量测序，分析肠道微生物组成。受试者体质及生物标志物情况见表1。
表1 受试者体质及生物标志物情况
2. 结果
2.1 TMAO与人口因素、肾功能标志物独立相关
将TMAO的水平与所有受试者的71个临床指标进行比较，发现其中27个与TMAO显著相关。肾功能标志物GFR和BUN的负、正相关性最强（图1），排除受试者的年龄、性别和种族因素后，相关性减弱。TMAO升高会导致肾脏损伤。将TMAO水平与受试者的年龄、性别、BMI进行比较，发现年龄和性别与TMAO水平正相关，调整GFR差异后，这种相关性仍存在。
图1 TMAO与肾功能标志物相关
2.2 TMAO与营养、炎症和血液蛋白标志物相关
Omega-3脂肪酸、IL-8水平与TMAO呈显著正相关，总蛋白和球蛋白水平（肾功能标志物）与TMAO水平均呈显著负相关。
2.3 肠道微生物代谢产物与TMAO显著相关，且受肾脏功能影响
实验发现252个代谢产物与TMAO水平显著相关。与TMAO呈正相关的前六种代谢产物中，有五种是肠道微生物的直接产物或衍生物，包括羟基吲哚硫酸盐、苯乙酰谷氨酰胺（PCG）、吲哚-硫酸盐（IS）、对甲酚-硫酸盐（PCS）、4-甲基儿茶酚硫酸盐。在以往对慢性肾病患者的研究中，发现这些代谢产物中有3种与心血管疾病有关（Lin et al.，2015；Poesen et al.，2016），说明肠道微生物代谢产物、TMAO与动脉粥样硬化之间存在着一定的联系。
肾功能正常受试者以及调整了GFR值后的受试者中，TMAO与微生物代谢产物之间的相关性仍然非常显著。为了进一步探讨代谢产物、TMAO和肾功能之间的关系，对高肾功能（HKF，GFR的上四分位数）和低肾功能组（LKF，GFR下四分位数）中TMAO水平降低的个体和TMAO水平升高的个体之间所有619种代谢产物水平进行了比较。LKF组中，除TMAO外的其它代谢产物在TMAO升高组和降低组之间无差异。而HKF组中，有5种代谢产物与TMAO水平有显著差异，包括4种微生物代谢产物（图2），说明在TMAO升高且肾功能高的个体中，肠道微生物在TMAO水平调节中起着关键作用。
图2 高肾功能、高TMAO水平的受试者中含量较高的代谢产物
与TMAO呈负相关的肠道微生物物种，大多为双歧杆菌科或双歧杆菌属（如长双歧杆菌），而双歧杆菌属在动物性饮食的个体中显著减少（David et al.，2014）。与TMAO水平相关的微生物列于表2中。
表2 与TMAO显著相关的微生物
基于16s结果，利用PICRUSt预测样本的功能组成。发现TMAO相关的甲烷代谢途径显著富集，TMA是甲烷代谢的底物之一，TMA水平的升高促进了以TMA作为碳源的产甲烷古生菌的生长。
2.4 TMAO与饮食、疾病相关的代谢产物显著相关
与饮食复杂的受试者相比，素食者的PCS和IS产量明显减少。胆碱和肉碱（动物食品的代谢产物）是微生物氧化三甲胺时最常见的底物，与TMAO水平密切相关。与其他代谢产物相比，含肉碱代谢产物与TMAO水平呈显著正相关。1-甲基组氨酸是食用动物类食物的标志物（Cross et al.，2014），与TMAO的相关性位列第三，说明饮食与TMAO水平关系密切。此外，一些含有甘油磷脂胆碱（GPC）的代谢产物与TMAO呈显著正相关，这是一种已知的血小板聚集因子（Albert and Snyder，1983），也是TMAO促进动脉粥样硬化的机制之一。二甲基鸟苷与TMAO呈正相关，与结直肠癌的发生相关。
受试者中，分别有36人、18人和50人自称吃素食、旧石器饮食（动物类食物为主）或低碳水化合物饮食。这104个人中，即使是在控制年龄和性别的情况下，饮食方式仍与TMAO的水平显著相关。旧石器饮食和低碳水化合物饮食与TMAO的相关性均显著高于素食饮食。
利用Spearman计算228种循环蛋白水平与TMAO之间的相关性，发现有40种蛋白与TMAO显著相关。其中生长/分化因子15 （growth/differentiation factor 15，GDF-15）相关性最强，GDF-15与冠心病患者的发病相关，而TMAO也与心血管疾病有关（Li et al., 2017; Tang et al., 2013; Wang et al., 2011, 2014），二者之间的关系值得深入探讨。Galectin-9和galectin-3与TMAO具有显著相关性，二者在动脉粥样硬化性卒中患者血清中的表达均高于对照组（He et al.，2017）。肾上腺髓质素和肾损伤分子蛋白也与TMAO水平相关，这两种蛋白与心血管或肾脏疾病具有一定的关联（Bunton et al.，2004）。
2.5 随机森林模型与代谢产物聚类分析
利用随机森林回归模型，研究多组学数据与TMAO水平的关系。结果表明，蛋白组学和代谢组学结果均与TMAO水平密切相关（图3），而该模型也可用于相关疾病的预测。随机森林模型中筛选到的特征性蛋白见表3。
图3 随机森林模型与TMAO水平预测
表3 随机森林模型中重要的特征性蛋白筛选
差异代谢物中，肉碱、胆碱或GPC代谢产物出现明显聚集，能够促进TMAO水平升高的主要聚类见表4。
表4 促进TMAO水平升高的聚类间的主要差异
讨 论
TMAO是心血管疾病发生发展过程中重要的危险因素。本文对TMAO与不同血液标志物、代谢产物、蛋白质、饮食和肠道微生物之间的关系进行了大范围、横断面和多组学分析。验证了TMAO与肾脏标记GFR之间的强相关性，进一步证明TMAO是一种肾功能预后生物标志物，并与年龄、性别和基线GFR无关。TMAO水平升高会导致肾脏损害。以往对人类和动物模型的研究中，一些发现男/雄性的TMAO水平更高（Chen et al.，2015；Mueller et al.，2015；Stubbs et al.，2016）)，一些则认为女/雌性TMAO水平更高（Bennett et al.，2013;Obeid et al.，2017）。TMAO水平因性别而异，主要是由于激素对FMO3基因（可将TMA转化为TMAO）表达的影响。本文的队列研究中，即使调整了年龄和肾功能因素后，男性TMAO的水平也明显更高。
另外，即使排除服用降胆固醇药物的受试者，也并未观察到TMAO与心血管疾病相关的血液标志物（如总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白或甘油三酯）之间的相关性。
TMAO相关的代谢产物和微生物，在动物性和植物性饮食的受试者中明显不同，表明饮食对肠道微生物组成和TMAO水平均有影响。同时，二者之间的关联在肾功能较高的个体中比在肾功能较低的个体中更为显著。在肾功能较高的个体中，TMAO水平受微生物活动的影响更大，而在肾功能较低的个体中，受肾脏过滤功能的影响更大。
然而，本研究也存在一些局限性。例如，心血管疾病预后情况缺乏随访记录，缺乏更完善的横断面研究，缺乏一份设计良好的饮食调查问卷，用于调查所有与TMAO有关的食物的消耗量，以便更深入地了解饮食、肠道微生物和TMAO之间的关系。
TMAO的水平变化及促进动脉粥样硬化的机制涉及一系列复杂的因素，包括饮食与肠道微生物及代谢产物的互作，以及血液循环中的蛋白质、代谢产物和肾功能等全身性因素。TMAO的多组学研究可为发现和预防CVD及其它相关疾病提供新的方法和途径。
参考文献
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