科研 | Microbiome：微生物组驱动甜菜采后病害的微生物指标
编译：沐秋，编辑：十九、江舜尧。
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贮藏腐烂造成的糖损失对制糖工业有着重大的经济影响。腐生真菌如镰刀菌和青霉在甜菜中的持续传播严重威胁到了甜菜的采后加工。检测甜菜微生物群落的变化可以在发生贮藏腐烂时提供具有针对性的对策。将细菌和真菌遗传标记的高通量测序与微生物培养的方法相结合，结果提供了对贮藏根定殖微生物群落的详细见解。这些数据被用于开发一种早期检测采后疾病的多靶向qPCR技术。
对奥地利和德国6个甜菜微生物组的比较突出了地区差异，也确定了健康状况的普遍指标。除腐烂甜菜的微生物多样性显著下降外，整个微生物组的分类组成也发生了显著变化。在腐烂甜菜微生物群中，念珠菌、青霉菌等真菌类群和革兰氏阳性乳酸菌是主要的致病指标。与此相反，出现在健康甜菜的微生物群中检测到了多裂孢子菌属和毗湿孢子菌属，以及更高的微生物多样性。根据这些发现，开发了一种基于qPCR的早期检测技术，并证实甜菜中的健康指标下降了2倍，疾病指标上升了1万倍。通过对贮藏样品中糖含量的分析进一步证实了这一点。
通过对甜菜贮藏过程中微生物组分变化的详细评估，确定了反映甜菜腐烂和含糖量损失的不同指示品种。本研究中产生的见解为通过跟踪贮藏期间的疾病指标改进当前或开发下一代采后管理技术提供了新的基础。
论文ID
实验设计
从奥地利和德国（巴伐利亚）的甜菜钳中获得健康（n=40）和腐烂（n=80）甜菜样品，从甜菜钳中的真菌菌丝巢中获得腐烂甜菜（附加文件1:图S3a，b）。选择重度和中度真菌感染的样本。健康甜菜采自无感染、无症状的感染甜菜钳周围地区。取样后，用50mL 0.85%氯化钠溶液将20克甜菜皮（主根和茎端表面）去皮并冲洗3分钟。制备所得溶液，用于随后的群落DNA提取。从腐烂的甜菜中提取的100µL溶液涂布在含有青霉素G（100 µg/ml）、硫酸二氢链霉素（50 µg/ml）和金霉素（10 µg/ml）的SNA板上，按1：10连续稀释，直至达到10-10的最终稀释浓度。此外，将表面消毒和洗涤后的病甜菜切片置于SNA板上，以获得在甜菜胚层中生长的真菌分离物。每株甜菜随机选取10株真菌，在PDA、SNA和琼脂平板（自来水+18g/l琼脂）上继代培养。在对不同平板上的单个菌株进行检测后，利用形态学聚类进一步对菌株进行分组。对每个形态簇的部分菌株（共120株）进行18S rRNA基因片段Sanger测序，质检之后的序列在NCBI数据库和UNITE v7数据库进行比对。
在8°C和75%相对湿度的控制条件下，采后直接贮藏20个未经处理和未受损伤的甜菜。在开始（T0）和每30天（T1、T2和T3）四个时间段对五株甜菜进行上述取样。用50mL氯化钠（0.85%）清洗甜菜皮20g。将总共4mL的溶液离心用于群落DNA提取。甜菜果肉中的糖含量用标准化ICUMSA测定，用冷水消化法测定糖（蔗糖）的极化度。
4 mL洗涤液离心（13000×g，20 min，4°C），并储存在-70°C。使用FastDNA®土壤试剂盒（MP生物医学, 美国）从所有样本中提取基因组DNA后，用16S rRNA引物514F和926R (GTGYCAGCMGCCGCGGTAA；CCGYCAATTYMTTTRAGTTT)及ITS引物ITS1F和ITS2R（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；GCTGCGTTCTTCATCGATGC）进行扩增子库的构建。在第二次PCR后，进行两次连续的PCR反应，并将所有三次进行的PCR反应汇集起来。第一次PCR（扩增V4和V5区域或ITS1区域）的总体积为10μL。添加的阻断引物mPNA和pPNA阻止了线粒体和叶绿体DNA的扩增。这些反应是在惠特曼生物测量公司（Biometra GmbH）的个人和辐射热循环仪上进行的，设置如下：95℃ 45秒，78℃ 5秒，55℃ 45秒，72℃ 90秒（35×），包括5分钟95℃的初始变性和5分钟72℃的最终延长。PCR反应后，用凝胶电泳检测其质量。在进行质量控制和适配器连接后，采用Illumina Hiseq对16SrRNA及ITS基因扩增子进行了测序。
使用QIIME 2（2018.6版本）和QIIME1.9.1分析通过扩增子测序获得的数据。在QIIME 1.9中加入正向和反向reads以及条码提取后，将数据导入到QIIME 2中进行进一步分析。解复用后，应用DADA2算法对特征表中的reads和汇总序列变量（SVS）进行去噪和截断。为了提高质量，过滤融合数据，线粒体和叶绿体读取（16S数据）或细菌和古细菌读取（其数据）也被丢弃。共分配了3489个ITS和8935个16S SVS（附加文件1：表S3）。α多样性、β多样性以及统计分析都是使用QIIME2进行的。在Silva v128和Unite v7.2数据库上以99%的相似性进行聚类分配。随后，计算每组（健康和腐烂）的核心微生物群（至少50%样本中存在的特征），并导出以条形图显示。使用FUNGuild在线工具对真菌特征表进行功能分析。
在QIIME 2中采用Kruskal-Wallis检验α多样性，用和Anosim检验β多样性。用PERMANOVA检验对参数解释的方差进行分析。用QIIME 2的ANCOM检验两组间存在的显著分类学差异。
在控制条件下从甜菜贮藏样品中提取群落DNA后，利用特异性引物进行qPCR扩增，以量化作为病害指标的不同分类群。针对念珠菌，镰刀菌，青霉，乳酸杆菌设计引物。使用Corbett Research TM热循环仪和SYBR Green PCR Master Mix TM进行定量。使用已知拷贝数的单个分离基因片段和连续1:10稀释获得标准曲线。每种标准稀释液设置三个重复以计算平均值。用标准品测定分析样品中的基因拷贝数。实施阴性对照（使用纯dH2O），并从分析样品中减去，以减少量化误差。
结果
为了从奥地利和德国的夹钳中鉴定受感染甜菜中的真菌类群，用真菌分离株18S rRNA基因片段的Sanger测序和Illumina扩增子测序重建群落结构（图1）。基于18S rRNA基因测序的120株真菌群落重建表明，该菌群落结构由11个不同属组成，以青霉属（37%）和镰刀菌属（22%）为主，而ITS扩增子测序表明其组成更为多样。共有80个扩增子数据集揭示了50多个不同的真菌属。优势菌属为多孢菌属（11%）、盖氏菌属（10%）、青霉属（10%）、念珠菌属（10%）、Mrakia属（8%）、Vishniacozyma属（8%）和四环菌属（4%）。虽然两种方法都有大量青霉，但镰刀菌只在基于分离物的重建群落中占优势。此外，从甜菜表面回收的真菌菌株比例最高（86%），但鉴定出的镰刀菌种类中，有相当一部分（39%）来自甜菜胚层。
对120份健康和腐烂甜菜样品的扩增子数据进行比较，发现与健康甜菜相比，感染样品中的细菌多样性显著降低（图2b）。Bray-Curtis距离表明，两组的微生物组分存在显著差异。在进行组间比较时，腐烂甜菜（n=80）的样本比健康甜菜（n=40）的样本聚集更为显著（p值≤0.01）。与聚集更紧密的健康样本相比，感染组内的变异更高（图2a）。
所鉴定特征的分类归属表明，所分析的甜菜中存在一种特属于腐烂甜菜的微生物群。健康样本和腐烂样本的比较显示，细菌和真菌扩增子中的分类群组成存在明显差异。变形菌是门级最丰富的类群，平均相对丰度为41%（健康样品）和51%（腐烂样品）。细菌（27%和12.5%）和放线菌（28%和11%）在两组中也非常丰富。两组之间的主要差异是硬壁菌门（0.4%和25%）。在腐烂的样品中，硬壁菌的主要成分属于乳杆菌类（24%）。健康样品中主要的变形菌属为假单胞菌纲（10%）、鞘氨醇单胞菌纲（9%）、根瘤菌纲（8.5%）、黄原菌纲（6.5%）和肠杆菌科（2.5%）。相比之下，在腐烂的样品中发现的51%的变形菌属为红螺菌（20%）、肠杆菌（8%）、假单胞菌（8%）、黄单胞菌（5%）、鞘氨醇单胞菌（4%）和根瘤菌（4%）。在目水平上，健康甜菜中最丰富的类群是黄杆菌目（21%）、微球菌木（21%）和假单胞菌目（10%），而腐烂甜菜的主要类群是乳酸杆菌目（24%）、红螺菌目（20%）和黄杆菌目（9%）。在属级上，乳杆菌属（18.4%）、葡萄糖酸杆菌属（16%）和亮菌属（11.3%）是腐烂样品中最丰富的类群，而黄杆菌属（20.6%）、假杆菌属（13.5%）和假单胞菌属（9%）是健康样品中最丰富的类群（图3a）。
ITS数据显示了健康甜菜和腐烂甜菜中的多种真菌微生物。真菌群落内共观察到60-62%的子囊菌和33%的担子菌。在纲水平上，在腐烂的样品中发现酵母菌纲和欧洲孢子菌纲的比例增加，而索道菌纲的比例减少。在目水平上，观察到囊尾蚴目的丰度增加，酵母菌目的丰度增加和Eurotiales目的丰度增加。在属水平上，观察到念珠菌属，青霉属，盖霍迈斯属和Mrakia属的分度增加。相比之下，健康的样本中，胸膜球菌属的数量以及毗湿霉属的数量增加了。这一点也表现在增加的类索道菌纲以及银耳菌纲的数量上。相比之下，在属水平上，腐烂样品中最丰富的属是全丝酵母属、盖氏菌属、假丝酵母属和青霉属（均为10%），而在健康样品中，全丝酵母属（21%）和毗湿霉属（18%）占优势（图3b）。
健康甜菜和腐烂甜菜的分类学差异伴随着核心特征营养模式的变化。健康样品主要由病理营养型（24%）和病理营养型腐生共生型（26%）真菌定殖。然而腐烂样品的营养分布以腐生真菌（39%）为主，其中病理营养真菌（14%）和病理营养腐生共生真菌（12%）的比例有所降低。总的来说，从健康甜菜的微生物群到腐烂甜菜的微生物群，病理营养和共生营养功能下降，腐烂功能增加（图4a）。
奥地利和德国的6种甜菜钳在多样性和分类学组成上存在显著差异。健康状况解释了甜菜变异的最大比例。不同的甜菜钳采样点也解释了16S中的13.6%和ITS数据集中21.7%的变异（p≤0.001），而组内的变异更高。甜菜样品的不同来源之间方差最小（图4b，c）。这些结果也反映在β-多样性PCoA图中，其中样本按健康状况分开（附加文件1：图s1、s2）。从格罗斯姆格尔（奥地利）的仓库中获得的样品与位于德国下半部的采样点（Mittich、Kleinweichs和Osterhofen）相比，表现出明显的微生物组成差异。然而，在地理位置上彼此靠近的采样位置显示出的差异不太显著。总的来说，从相对平衡的细菌类群（健康甜菜的微生物群）到占优势的乳酸杆菌，以及红螺菌（腐烂甜菜）在每个采样点都有明显的变化。真菌群落从一个以毗湿霉和多胞菌为主的微生物群落转变为越来越多的青霉和念珠菌物种（图5）。
根据代表性样品中的微生物丰度差异，选择指示健康甜菜或腐烂甜菜微生物组的特定速率（图3和5）。在健康甜菜中，细菌群落中的黄杆菌和假丝酵母菌以及真菌群落中的多胞菌和粘孢子菌占优势。相比之下，在腐烂的甜菜中，乳酸杆菌、葡萄糖酸杆菌、假丝酵母菌和青霉则普遍存在。通过对贮藏甜菜中微生物指标的特异性引物进行实时qPCR分析，发现病害指标逐渐增加，健康指标同时丧失。在为期3个月的贮藏试验中，观察到念珠菌、镰刀菌和青霉的增加以及毗湿霉的同时减少（图6a）。为了验证qPCR引物鉴定样品中的疾病进展情况，用保存的样品对甜菜碳水化合物进行了补充分析。在控制条件下贮藏的甜菜，在3个月的贮藏期内，蔗糖含量下降了3个百分点。
讨论
本研究的结果首次详细描述了在工业规模的、不受控制的环境中常规贮藏甜菜的微生物群落特征。通过不同种方法的结合使用，建立了甜菜腐烂病病原菌的整体评价模型。对120株真菌18S基因测序结果与扩增子数据进行了比较。相比之下，86%在属级鉴定的分离真菌也存在于扩增子库中。与扩增子测序数据相比，真菌分离株的培养依赖性鉴定显示了某些大量存在的分类群，如青霉和镰刀菌。这可能是由于分离过程中的特定程序可能会影响分离菌株的频率。在提取总DNA的同时，将感染甜菜的表面消毒片段置于琼脂平板上进行分离。这可能有助于镰刀菌物种的分离，因为这种病原体主要定植于植物内胚层。通过高通量测序获得的真菌ITS文库显示了不同真菌类群的总体多样性，部分原因是由于某些类群在标准分离培养基上的可培养性限制引起的。
前已证明微生物多样性以及微生物群落的明显变化与疾病发生率有关。本研究中获得的数据支持了这样一个假设：细菌和真菌群落中的较低多样性与对微生物群落变化的较高敏感性有关，而微生物群落变化实质上改变了群落结构。细菌和真菌数据集中多样性指数的显著下降反映了腐烂样品中微生物多样性低。与本研究结果相似，当比较健康和患病洋葱时，发现贮藏洋葱中的微生物多样性发生了变化，并且发现健康冬小麦根系中的真菌多样性更高。此外，多样性的减少也有助于病原物种入侵群落。
尽管基于扩增子的测序可能会受到某些偏差的影响，但利用该数据集获得的细菌和真菌甜菜微生物组的分类组成主要与取样甜菜的健康状况有关。甜菜钳的地理位置对观察到的变异性的作用不太显著。同样，此外，Liebe等人（2016）也观察到甜菜在不同温度下贮藏时也有类似的效果。根据贮藏条件，不同的甜菜含有特定的真菌类群，而起源环境产生的影响较小。在这项研究中，甜菜在常规条件下贮藏，在腐烂的甜菜中显示出以假丝酵母、青霉、盖氏菌和多孢菌为主的真菌群落。真菌群落内的营养模式也反映了观察到的分类变化。用腐烂甜菜的腐坏功能代替健康甜菜的主要病理营养和病理营养。然而，致病真菌的丰富程度与特定的健康状况无关。
通过对贮藏甜菜健康和腐烂样品的比较，确定了不同的潜在生物标记物。在健康甜菜中发现的坏死性真菌谱系Plectosphaerella，以前被证明是一种促进甜菜生长的微生物。此外，据报道，它是一种潜在的生物防治剂，对马铃薯胞囊线虫有效。以往对甜菜贮藏的研究大多是在甜菜贮藏前观察到这一类群。其它与健康相关的类群，如黄杆菌和假丝酵母菌，已被报道证实它们在不同植物的根际，以及在植物防御机制或生长促进中的作用。与腐烂甜菜相关的其它类群，如青霉，是典型的腐生真菌和采后病原菌。乳酸杆菌和假丝酵母菌属主要在腐烂的甜菜中检测到，它们与糖发酵成酸或醇的化合物有关。
根据已确定的甜菜贮藏中的健康和疾病指标进行实时qPCR分析，为此类指标适用于农业管理战略提供了一手证据。由于这些数据是在小规模实验中获得的，因此必须在今后的方法中进一步扩大，以确定其应用到工业规模的可靠性。在三个月储存期内，与健康有关的指标会下降或者保持不变。相比之下，与疾病有关的指标在储存期间大幅度增加。对这些分类群的定量分析表明，在贮藏过程中，随着微生物蔗糖浓度的降低和蔗糖转化率的增加，病害逐渐增强。
结论
甜菜贮藏腐病伴随着微生物丰度的变化。本研究强调了细菌和真菌群落中与贮藏根腐烂发生率相关的变化。某些特定分类群的变化可能预示着早期的腐烂症状，并有助于实施有针对性的对策。真菌群落的分类学变化伴随着营养专一性。这一见解为设计合适的生物防治剂提供了基础，以保持与健康甜菜微生物群相关的分类群的平衡，并防止产生降解微生物。此外，疾病指标的确定可作为决策工具，并支持在储存管理期间优先处理收获的甜菜。此外，还需要对此进行进一步的研究，以确认所获得结果的可实施性，并指定定量测量的级别，从而能够准确指示疾病的程度。
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