科研 | 湖南农业大学：硼通过促进镉与根细胞壁成分的螯合来减轻甘蓝型油菜中的镉毒性（国人佳作）
编译：王一，编辑：Emma、江舜尧。
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背景：自20世纪初以来，全球农田镉（Cd）污染日益严重。镉在植物中积累会严重影响植物的生长发育，作物的产量质量，并通过食物链的累积放大效应最终威胁人类健康。在中国南方，通常在高镉和低硼（B）土壤上进行水稻-油料作物轮作。硼可减轻镉的毒性，因为它影响着植物细胞壁结构和组分，可阻止镉进入细胞质；然而这些机制并没有完全阐述清楚。本研究目的是1）确定硼如何调控油菜对镉的吸收，以及镉在根系中的亚细胞分布；2）调查硼对根细胞壁结构和组分的影响，以及镉的结合特征；3）揭示镉胁迫下硼的施用涉及到的细胞壁组成和结构响应的基因和代谢物。最终揭示硼调控油菜根细胞壁的结构和成分以缓解镉毒性的生理和分子机制。
方法优势与创新：本研究使用了傅里叶变换红外光谱（FTIR），荧光探针染料法，电子显微镜，离子丰度法（电感耦合等离子体质谱），代谢组学和转录组学等方法进行了相互验证与综合分析。
结果：发现镉胁迫下，硼可以影响生物合成途径，降低果胶酶活性和相关基因的表达水平来增加根中的果胶含量。果胶含量的增加和果胶去甲基化作用增强了镉在细胞壁上的螯合作用，并降低进入细胞器的镉含量。施用硼可将根部细胞壁中纤维素和半纤维素含量降至正常水平，并促进膨。胀素，木葡聚糖内糖基转移酶和α-木糖苷酶家族基因的基因表达，有助于细胞壁的完整性和根系柔韧性。进而抑制了活性氧的积累，增加了根部细胞的活力，减少了根表面结构的损坏。这些结果提高了我们对硼如何参与镉在细胞壁上的螯合作用，并维持细胞壁完整性的理解，从而能提高油菜根对镉的抗性。
论文ID
实验设计
1. Cd0B0.25 (0.25 μM BO33−);
2. Cd0B10 (10 μM BO33−);
3. Cd0B25 (25 μM BO33−);
4. Cd0B50 (50 μM BO33−);
5. Cd0B75 (75 μM BO33−);
6. Cd2B0.25 (2 μM Cd2+, 0.25 μM BO33−);
7. Cd2B10 (2 μM Cd2+, 10 μM BO33−);
8. Cd2B25 (2 μM Cd2+, 25 μM BO33−);
9. Cd2B50 (2 μM Cd2+, 50 μM BO33−);
10. Cd2B75 (2 μM Cd2+, 75 μM BO33−)
5天后观察每组叶片黄化情况，并分别称量根和茎干重，对镉浓度进行检测。
1. −B+Cd (0.25 μM BO33−, 2 μM Cd2+);
2. +B+Cd (50 μMBO33−, 2 μM Cd2+);
3. −B−Cd (0.25 μM BO33−)；
4. +B−Cd (50 μM BO33−).
取样用于以下实验：根系构型分析；叶片光合色素含量，根系活性，细胞活力，丙二醛含量，活性氧种类和抗氧化酶含量测定；扫描电镜和透射电镜；硼和金属元素浓度测定；亚细胞组分分离以及镉的亚细胞分布分析；细胞壁的FTIR分析；细胞壁组分萃取和测定；果胶甲酯酶、果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶的测定；代谢物测定、mRNA文库的构建及转录组分析
实验结果
1. 硼可以缓解镉诱导的叶片黄化和根系生长抑制
实验一中，油菜的根和茎干重和镉含量分析表明硼有效缓解了镉积累毒性。50 μM的硼浓度足够维持油菜的正常生长，并能显著降低根茎的镉累积水平。因此选用50和0.25 μM的硼浓度用于后续实验二。
实验二中镉处理5天后，不管有无硼添加均造成显著的叶片黄化。但硼确实在一定程度上缓解了镉毒性，因为施用硼后，叶片黄化症状较轻且叶绿素含量相对较高（图1A-C）。根系构型参数（总长，表面积和体积）也显示硼的施用有效缓解了镉毒性带来的根系生长抑制。此外，+B+Cd处理组的根总长和体积值比−B+Cd处理组要高（图1E和G），且根系干重前者也显著高于后者（图1H）。
图1 不同浓度硼和镉处理下油菜的生长表型（A，B），叶绿素含量（C），根系形态参数（D-G）和根干重（H）
2. 硼减轻镉诱导的根系氧化应激
为研究镉毒性胁迫对根细胞的氧化应激，以及硼的添加对根系损伤的缓解作用，考察了根的细胞活力，ROS可视化分布，超微表面形态结构。结果发现在+B和−B组，镉毒性胁迫都显著降低了根系活力以及根细胞中的红色荧光，而无镉对照组的植物根部表现出清晰的绿色斑块（图2A和B）。在镉胁迫下，添加硼后，根系活力以及根细胞红色荧光显著增强（图2A和B）。图2C和D的ROS可视化显示硼处理降低了镉胁迫根部的荧光强度和H2O2含量。结果表明硼的施用能很好缓解镉胁迫引起的氧化应激，修复细胞损伤，提高细胞活性，能够在镉胁迫下促进根系生长。
完整的根表面结构有助于阻止镉进入细胞。图2E显示镉胁迫损坏了油菜根系形态，导致不规则表面的形成和表皮细胞的严重损伤。而硼添加情况下受镉胁迫的根表面更为光滑，表明硼添加有助于根表面结构的完整性，进而减轻镉胁迫损伤。此外，图2F的透射电镜结果展现出镉胁迫下根尖细胞呈歪曲杂乱状，并伴随有细胞核降解现象。因此硼的施用可以有效缓解镉胁迫下细胞壁的崩解和原生质体的破裂（图2F）。
图2 硼和镉对根系活力（A），细胞活力（B），ROS积累（C-D），根表面形态（E）和亚细胞结构（F）的影响
3. 硼对根和芽中镉积累的影响差异
为确定不同处理油菜吸收硼和镉是否会互相影响，检测了根和茎中硼和镉的含量。结果表明镉对硼含量无显著影响（图3A），而硼的施用对镉含量有显著降低作用（图3B和C）。计算根和茎中的镉累积含量后，结果表明硼显著降低了茎中镉含量，但并不影响根部镉的累积（图3D）。
图3 不同处理根和茎中的硼含量（A）和镉含量（B-C）以及镉累积量（D）
4. 硼改变根中镉的亚细胞分布
植物吸收镉主要积累在根部。细胞壁保留和液泡隔离有助于降低镉对植物的整体毒性。为研究硼对油菜根系镉的亚细胞分布的调控作用，对各细胞组分的镉含量进行了检测。镉胁迫处理下硼的施用显著增加了细胞壁组分的镉含量，降低了细胞器中的镉含量，但并不影响可溶组分的镉含量（图4A-C）。硼的施用导致油菜根部细胞壁和细胞器的镉亚细胞分布比率分别增加了27.33%和降低了34.29%（图4D）。结果表明硼增加了镉在细胞壁上的螯合作用，抑制了镉移动进入细胞原生质体，从而缓解细胞毒性。FTIR分析显示硼施用后根系细胞壁中有高丰度的羧基和羟基（图4E），表明硼通过增加带负电荷的活性化学基团来促进镉在细胞壁上的结合。
图4 −B+Cd (0.25 μM BO33−, 2 μM Cd2+)和+B+Cd (50 μMBO33−, 2 μM Cd2+)处理组根系不同细胞组分镉含量（A-C），镉的亚细胞分布（D）和细胞壁负电荷官能团的相对丰度（E）
5. 硼增加了镉毒性胁迫根系中果胶和与可溶性果胶螯合态的镉含量
在植物细胞壁中，果胶，纤维素，半纤维素和木质素可以固定和沉降镉，以减少细胞损伤。图4展示出硼施用后根细胞壁有大量镉分布。与−B+Cd处理组相比，+B+Cd组根细胞壁中有更高浓度的水溶性果胶（WSP），离子可溶性果胶（ISP）和螯合可溶性果胶（CSP）（图5A）。然而，硼并未影响根细胞壁中木质素的含量（图5B）。此外，镉胁迫处理组中硼的施用导致根系更低的纤维素和半纤维素含量（图5C和D），这有助于维持细胞壁结构。
进一步测定了离子可溶性果胶，螯合可溶性果胶，纤维素和半纤维素中的镉含量。发现硼并未影响离子可溶性果胶和纤维素中的镉含量，但显著增加了螯合可溶性果胶和半纤维素中的镉含量（图6A-D）。与图5中展示的结果一起来看，发现硼不仅增加了果胶含量，且增加了结合到螯合可溶性果胶上的镉含量，减少了细胞壁半纤维素含量，并促进了镉与半纤维素的结合。
图5 硼和镉对细胞壁结构的影响以及油菜根不同细胞壁组分的镉含量
图6 不同处理组中涉及到的细胞壁果胶合成，降解和脱甲基化的一些代谢物，酶和差异表达基因（DEGs）的转录特征响应
6. 镉毒性胁迫根系对硼施用的代谢和转录响应
生理学分析表明了硼对细胞壁组分的调控是提高油菜根系镉抗性的主要原因，果胶是将镉结合到细胞壁上的主要细胞组分之一，硼的应用不仅增加了果胶含量，并且增强了其螯合镉的能力。为进一步验证这个结论，应用LC-MS/MS鉴定了涉及果胶合成的代谢物，应用转录组测序检测到120个与根细胞壁相关的差异表达基因（DEGs），其中70个涉及到果胶生物合成，降解和脱甲基化。
图6A展示了果胶的生物合成通路，该图暗示了镉毒性胁迫下硼的施用降低了D-葡萄糖和UDP-D-半乳糖醛酸的相对浓度，但增加了D-葡萄糖-6-P，肌醇和D-葡萄糖-1-P的相对浓度。这表明硼促进了D-葡萄糖向D-葡萄糖-6-P，D-葡萄糖-6-P向肌醇和D-葡萄糖-1-P转化的进程。转录组学表征的肌醇-1-磷酸（MIP）合成酶也证实了这一点。UDP-D-半乳糖醛酸是果胶前体，其浓度的降低可能是果胶生物合成加快造成的。此外，根系代谢组学检测到5种果胶单糖（图6B）。镉胁迫处理下，硼对根系的D-（+）甘露糖和L-果糖并无影响，而L-阿拉伯糖，D-果糖和D-半乳糖醛酸的丰度随硼的施用显著升高。表明了硼为油菜根系提供了更多单糖以促进果胶的生物合成。
使用化学比色法，确定了根细胞壁中果胶甲基酯酶（PME）和三种果胶酶（果胶裂解酶，聚半乳糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶）的活性。在硼足够的情况下，镉降低了果胶裂解酶活性，却显著提升了聚半乳糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶的活性。此外，镉毒性胁迫下根的3种果胶酶活性由于硼的施用而下降（图6C-E）。3种酶的转录组学表征也证实了这一点。镉胁迫下有无硼添加处理的差异比较鉴定到14个涉及聚半乳糖醛酸酶的DEGs，硼分别上调和下调了3和11个DEGs（图6H）；鉴定到20个涉及果胶裂解酶的DEGs，分别上调了7个和下调了13个DEGs（图6G）；鉴定到10个涉及β-半乳糖苷酶的DEGs，其中1个上调，9个下调（图6I）。这些结果揭示了镉胁迫下硼的施用可抑制果胶降解。
图6F表明硼增加了根系PME活性。转录组数据也证实了镉胁迫下硼促进了根系PME家族基因的表达（图6J），并抑制了涉及PME抑制蛋白基因的表达（图6K）。有硼处理与无硼处理相比，PMEs的7个DEGs表现出较高比例的转录丰度（85.6%），而镉胁迫下根系的17个与PME抑制蛋白相关的DEGs中，有14个受硼施用下调。这些基因对硼施用的响应与果胶的脱甲基化相关，并为镉在细胞壁上提供了更多结合位点，从而增强油菜根系的镉抗性。
除了根系果胶相关的转录组学表征，研究人员还分析了参与细胞壁组织，大分子代谢和停留，纤维素，木质素和半纤维素合成和降解的50个基因的表达模式。与-B+Cd处理组相比，+B+Cd处理组分别有1个和3个与细胞壁组织和大分子代谢的DEGs上调和下调，这表明了硼促进了细胞壁组织形成和代谢。膨胀素和木葡聚糖内糖基转移酶被认为是细胞壁松弛和细胞伸长的重要物质，而木葡聚糖是植物原代细胞壁中最重要的半纤维素。木葡聚糖内糖基转移酶催化自身与木葡聚糖分子之间的连接，以控制细胞壁的机械强度。此外，α-木糖苷酶在木葡聚糖重塑和维持细胞壁完整性中起重要作用。在镉胁迫下对有无硼添加处理组进行差异比较，观测到20个膨胀素家族DEGs，其中硼的施用导致13个上调，7个下调。硼处理显著增强了木葡聚糖内糖基转移酶家族13个基因中10个的表达丰度，且硼调控着α-木糖苷酶相关基因。转录组学数据暗示了+B+Cd处理中，5个纤维素合成酶基因中的4个，4个纤维素酶活性基因中的3个均有较高的表达丰度。这些结果表明镉毒性胁迫下硼的施用促进了调控细胞壁组织和代谢，纤维素生物合成和降解之间平衡的基因表达，从而有助于维持根系细胞壁完整性和柔韧性。
讨论
硼的施用可以减少植物中的镉含量并提高作物产量。最近的一项研究表明，硼通过下调镉转运基因以减少水稻中的镉吸收和转运，进而改善镉诱导的氧化胁迫并减轻镉毒性。有报道指出硼通过影响ROS信号通路和程序性细胞死亡（PCD）进程相关的基因表达，从而抑制镉胁迫诱导的PCD。镉浓度过高会引起ROS积累，造成氧化应激而导致细胞死亡。本研究结果表明硼的施用均缓解了油菜中的镉毒性症状和根系生长抑制（图1）。此外，还发现硼降低了根系中的ROS氧化损伤（图2CD），植物中的镉含量，但并未影响油菜根系的镉积累（图3D）。离子组学表明硼对油菜根部吸收累积其他重金属离子并无显著影响。据我们所知，之前还未有研究关注硼调控细胞壁结构和组分以缓解镉毒性的生理生化和分子机制。有报道鉴定了镉毒性作用下植物超微结构和形态学的很多变化，包括根毛，气孔大小和数量，叶绿体和过氧化物酶体。本研究中，首先观测了镉毒性造成的严重的根部表面结构和细胞形态损伤，其次研究了硼的施用缓解根表面和细胞结构的形态学损伤（图2EF），这可能是由于硼添加增强了根系的镉毒性抗性。
前人研究已发现细胞壁和液泡在提高植物镉抗性方面发挥重要作用，且镉更倾向于累积到细胞壁组分。有报道发现苎麻根系80%的镉都存在于细胞壁，水稻中有70-90%的镉被固定在细胞壁。本研究将根细胞分离为3个组分：细胞壁，细胞器和可溶组分（细胞质和液泡中的大分子有机质和无机离子），并计算镉的亚细胞分布。结果发现大多数镉位于细胞壁，硼的施用增加了根系中细胞壁镉的比例。然而，硼的施用对液泡中的镉含量和分配比率无显著影响（图4），暗示了硼可增强油菜根系的镉抗性，但并不是因为液泡的隔离作用。人们普遍认为钙（Ca）在细胞壁结构和稳定中也起重要作用，结合到细胞壁上的金属离子可以在其结合位点被其他阳离子交换，然而，镉胁迫下硼的施用对除镉以外的所测金属离子（Mn，Mg，Cu，Zn，Na，K，Fe，Ca）在细胞壁上的亚细胞分布均无显著影响。离子组学表明了镉胁迫下硼的施用并不会显著影响8种金属离子在细胞壁上的累积，因此排除了其他离子对细胞壁结构和完整性的影响。细胞壁上活跃的负电荷化学官能团在细胞壁螯合镉中发挥重要作用，根细胞壁的FTIR光谱表征了负电荷自由官能团的丰度，硼和镉处理下的根细胞壁显示出与COO–和–OH拉伸变化相对应的峰的相对吸光度更高，这是细胞壁中镉结合能力提高的主要原因。硼也影响根中Ca，Cu，Mn和Zn的亚细胞分布，但其影响程度要小于镉。
已有广泛报道表明细胞壁组分的生物合成需要硼，这些细胞壁组分中，果胶是固定镉的主要成分，且果胶脱甲基作用主要受PME调控。本研究中，油菜镉胁迫下硼的施用不仅增加了WSP，ISP和CSP的含量，也增加了PME的活性，从而为果胶提供了更多羧基和羟基，特别是CSP能够有效固定镉（图5A，6E，J，K），被子植物中的单糖主要包括木糖，鼠李糖，海藻糖，阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖和甘露糖，果胶中增加的单糖含量可促进拟南芥的果胶合成。通过分析根部代谢物，观测到硼的施用增加了镉毒性胁迫根系的许多果胶单糖含量，并且发现硼影响了果胶合成通路中许多果胶底物的合成（图6B）。果胶甲基酯酶（PME）可以从果胶中除去甲基，并在果胶链上留下羧基，从而在细胞壁内形成镉的结合位点。最近，有研究人员从猕猴桃和拟南芥中分离出了小蛋白质PME抑制剂（PMEIs），并在体外和植物体内都广泛证明了PMEIs降低PME活性的能力。本研究转录分析表明镉处理下有7个与PME相关的DEGs和17个与PMEI相关的DEGs对硼的施用产生了响应性差异表达，6个基因包括PME1，PME3，PME68和PPME1的高水平表达表明了增强了的果胶脱甲基作用（图6J）。有报道表明番茄PME1受镉胁迫显著上调表达，而PME3已被确定为参与镉毒性下油菜中果胶脱甲基酯化调控的核心基因。尽管PMEIs被认为参与广泛的生物和非生物胁迫进程，据文献调研，很少有研究识别到镉胁迫下油菜根系中的PMEIs，PMEI11在植物免疫学中是保护细胞壁完整性的重要调节器。本研究首次识别到PMEIs，且硼的施用促进了PMEI11和PMEI17的表达（图6K）。此外，还研究了果胶酶和相关的DEGs的活性。人们普遍认为，植物可以通过降低镉毒性下的果胶酶活性来增加果胶含量。本研究中，镉胁迫降低了油菜根中β-半乳糖苷酶的活性，但降低了无硼组的聚半乳糖醛酸酶的活性和有硼组的果胶裂解酶的活性。应当注意的是，在镉胁迫下施用硼显著增加了三种果胶酶的活性，减轻了根中果胶的降解，并提供了更多的果胶来减轻油菜中镉的毒性。果胶酶活性相关DEGs的下调进一步证实硼延迟了镉胁迫下油菜根系中果胶的降解过程（图6C-E，G-I）。
此外，细胞壁相关基因的变化表明，在镉毒性下施用硼有利于促进细胞壁组织和细胞壁扩张，进而维持根部细胞壁的结构和完整性，并抑制细胞壁分解代谢。膨胀素是广为人知的细胞外蛋白，可在体外增加植物细胞壁的可扩展性。木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶（XTH）也是调节细胞壁松弛的关键细胞壁重塑酶。在镉胁迫根系中，该研究识别到膨胀素相关的7个下调DEGs和13个上调DEGs，XTHs相关的3个下调DEGs和10个上调DEGs。硼诱导的变化增加了细胞壁的机械强度，并保持了正常的细胞形态。α-木糖苷酶在细胞壁完整性的保持中发挥重要作用，据报道XYL1缺失突变体表现出不良的细胞壁松动，生长和发育状况。在硼和镉处理的根中观察到较高的XYL1 mRNA水平，这表明硼施用导致增强的α-木糖苷酶活性。纤维素是植物细胞壁的主要聚合物之一，本研究发现镉胁迫下硼的施用可促进4种纤维素合酶基因的表达并抑制3种纤维素酶基因的表达。然而，硼的施用对镉胁迫下根系的转录响应最终导致根细胞壁中纤维素含量显著降低（图5D）。
总之，通过对形态学，生理学，代谢组学和转录组学数据的综合分析，结果逐渐验证了初步假设，图7显示了研究结果的示意图。在镉毒性下，硼的施用促进了油菜根细胞壁中果胶的生物合成并抑制了果胶的降解，并且提高了PME的活性，为细胞壁中镉提供了更多的结合位点。果胶和膨胀素的增加以及细胞壁中纤维素和半纤维素的减少也有助于减轻镉对细胞壁和根部表面结构的损害，根中较低的ROS积累也有助于增加细胞活力并促进根的生长。油菜是我国南方稻油轮作区重要的油料作物，土壤中硼含量低，镉含量高。硼是植物必需的微量营养元素，不仅促进了油菜的生长和生物量，而且提高了其对镉的抗性。该研究结果表明硼可以通过促进镉螯合到油菜根细胞的根细胞壁上来减轻镉毒性，此外，结果还确定了硼如何调节油菜中镉毒性的生理和分子机制，因此，在农业生产中可以同时施用硼肥以增强油菜对镉的抗性。
图7 镉胁迫下硼对油菜根系形态和活性的调控以及镉的亚细胞再分配的模型示意图
镉胁迫下硼的施用促进了果胶的去甲基化，并通过促进果胶的合成和抑制果胶的降解来增加果胶的含量，从而提供更多的镉结合位点以将更多的镉固定在细胞壁上，从而增强根对镉的抗性。硼减轻油菜根种镉的毒性作用，增加了细胞活力，缓解了镉对根形态结构的伤害，最终促进了根的生长。