2020年2月22日，美国冷泉港实验室 (CSHL) David Jackson研究组在Nature Plants发表了题为Enhancing grain-yield-related traits by CRISPR–Cas9 promoter editing of maize CLE genes的论文（刘磊博士为该论文的第一作者）。该研究利用CRISPR/Cas9系统对玉米CLE基因启动子进行编辑，创制了玉米高产等位基因。
作物产量的遗传改良育种，经历了数次变革。第一代的育种策略，是基于种质源收集、评估和筛选，保留高产优质种质资源进行种植；第二代育种策略标志性事件是杂交育种概念的提出和应用，通过自交系间杂交，获得杂交种，而杂家种由于杂种优势的效应，其产量显著高于双亲，同时化肥杀虫剂等应用，以及矮秆基因在多个作物中的应用，提高了作物的产量；随着生物技术的发展，通过转基因技术、分子标记辅助选择、全基因组选择等，进一步提升了作物的产量等。然而，随着全球人口激增，气候变化对作物产量的不利影响，对基于玉米等作物的生物能源的需求增长等，对作物产量提出了更高的要求。现代玉米的驯化和改良起源于约10,000年前，由玉米野生种大刍草 (Zea mays ssp. Parviglumis) 经过长期的驯化选择，演化为玉米地方品种（landrace），再经过约150年的遗传改良，进而发展出适应性好、籽粒产量高的优良玉米品系。在此过程中玉米对光周期适应性、植株形态、果穗大小、籽粒产量等性状，发生了极为显著的变化（Duvick 2005; Doebley et al 2006）。其中，玉米的产量性状受到强烈的选择，野生种大刍草果穗仅有数十粒籽粒，而现代玉米果穗则多达数百粒，提升玉米单穗的籽粒数可显著提升玉米的产量。玉米是雌雄异花植物，玉米的果穗（雌穗）为雌花序，发育出雌花，并通过接受雄穗雄花的花粉，受精后最终发育成籽粒。玉米果穗籽粒数目，是在受雌花序发育早期形成和决定的（Vollbrecht and Schmidt 2009）。玉米的雌花花序一般在9-10叶期开始发育，此时位于叶腋处的叶腋分生组织（Axillary Mersitem, AM）转换成花序分生组织（Inflorescence Meristem, IM）（Vollbrecht and Schmidt 2009）。随后，IM上形成多行排列整齐的分生组织，即成对小穗分生组织（Spikelet-Pair Meristem, SPM）。每一个SPM进而分化出两个短分枝的分生组织：小穗分生组织（Spikelet Meristem, SMs）。每个SM最终经历小花分生组织和花器官的分化，授粉后发育成成熟的籽粒（Vollbrecht and Schmidt 2009）。因此，玉米雌穗发育过程中IM持续分化SPM的能力及SPM分化SM的能力，决定了最终玉米果穗上的每穗行数、行粒数等产量性状（Vollbrecht and Schmidt 2009）。因此，提升玉米花序分生组织活性，理论上可增加果穗籽粒数目，提升产量。玉米花序分生组织（IM）的建成和维系，是玉米花序正常发育的基础。和其他分生组织类似，IM主要发挥两方面作用：通过植物干细胞（Stem cell）的分化起始其他组织器官的发育；通过细胞的分裂进行自身的增殖（Vollbrecht and Schmidt 2009）。在植物中，维持花序分生组织生长和分化的经典途径是CLAVATA-WUSCHEL feedback loop，其中包括在IM中部特异表达的WUSCHEL（WUS）基因，在IM中特异表达的CLAVATA1（CLV1）和CLAVATA2（CLV2），以及负责WUS向CLV1和CLV2进行信号传递的CLAVATA3（CLV3）信号分子（Williams and Fletcher 2005）。拟南芥中WUS基因的产物可促进分生组织的生长及CLV3信号分子的表达，CLV3可以和CLV1-CLV2复合体互作，进一步抑制WUS的表达，因此形成一个动态平衡的负反馈回环通路，维持分生组织的分化活性（Williams and Fletcher 2005），打破此通路平衡的突变体，表现为分生组织过度增殖（Williams and Fletcher 2005）。CLV-WUS通路在植物中相对保守，在玉米中鉴定了拟南芥CLV1、CLV2和CLV3的同源基因突变体thick tassel dwarf1（td1）（Bommert et al 2005）、fasciated ear2（fea2）（Taguchi-Shiobara et al 2001; Bommert et al 2013a）及Zmcle7、Zmfcp1（Rodriguez-Leal et al 2019）。这些突变表型类似，均表现为IM的增大，雄穗雌穗增粗、穗行数增加等表型。然而这些突变体，由于分生组织过度增殖，导致果穗发育异常，因而显著降低产量。美国冷泉港实验室David Jackson研究组利用EMS等技术创制的fea2的弱突变体，可保证果穗正常发育，且提升了分生组织活性，进而数量上提升了穗行数等产量性状，因此通过对这些基因的人为改造，精细优化它们的生物学活性，对优化玉米分生组织活性、提升玉米产量，具有重要的潜在价值。Rodríguez-Leal等人利用CRISPR-Cas基因编辑技术，对番茄的CLV3基因进行调控序列的编辑，获得了可以调控番茄果实大小数量变异的新的等位基因，实现了利用基因组编辑技术对目的基因进行人为设计（Rodríguez-Leal et al 2017）。因此应用基因组编辑技术可以进一步创造优良等位基因资源，快速应用于玉米的遗传改良，在玉米育种中的具有广泛的应用前景（Wolter et al. 2019）。玉米的CLAVATA3（ZmCLE7和ZmFCP1）是一类短肽信号分子，其将信号传递给CLAVATA1（TD1）、CLAVATA2（FEA2）及FEA3，并通过他们抑制WUSHEL基因的表达，进而形成一个反馈调控的信号通路，精准调控花序分生组织发育。为了获得其弱突变等位基因，该项最新研究探索利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，靶向其启动子区域，获得影响其表达量的弱突变体。针对ZmCLE7和ZmFCP1启动子区域，研究者利用ATAC-seq和MNase-seq等数据进行染色质开放区域（accessible chromatin regions）的分析，同时利用进化分析，预测启动子区域可能的保守的调控位点，并分别设计9个sgRNA，靶向其启动子区域。通过筛选，ZmCLE7和ZmFCP1启动子区域分别筛选到数个大片段的缺失和倒位的编辑事件。这些编辑事件可显著改变基因的表达水平，数个启动子编辑等位基因可使表达量数量水平降低~45% - ~69%。其中ZmCLE7启动子倒位编辑的等位基因，却使得ZmCLE7表达部位扩展到IM内部。通过进一步的表型分析发现，一些启动子缺失编辑的等位基因，可一定程度的提升花序分生组织的大小，进而显著提升数个产量相关性状及单穗的籽粒产量。它们在自交系背景及杂交种背景下，均能显著提升产量。这些等位基因对产量的提升，主要体现在果穗增粗、穗行数增加、单穗粒数的增加；相对于对照，在穗行数上的提升十分显著，提升了~6行，且粒重未出现显著变化，最终单穗产量提升约最多至~26%。该研究还发现，其中一个启动子倒位的编辑等位基因，扩张了ZmCLE7的表达部位，因此导致果穗变小，降低了产量。这些结果表明，对ZmCLE7和ZmFCP1启动子的编辑，可以通过数量上调节基因表达，影响其对玉米花序分生组织活性的影响，影响玉米产量性状的数量变异，显著提升玉米的单穗产量。玉米中的CLAVATA3（ZmCLE7和ZmFCP1）的同源基因共有49个，研究者前期研究发现，CLAVATA3及同源基因，在多物种中往往都具有功能冗余的特性。例如在Zmcle7突变体中，ZmFCP1可通过表达量上调，弥补一定的ZmCLE7的功能。研究者进而通过对Zmcle7突变体转录组的分析，筛选到了另外一个CLAVATA3同源基因ZmCLE1E5，其在Zmcle7突变体中，也表现为表达量上调。研究者对其编码区进进行编辑，获得了两个不同移码突变的null alleles突变体。Zmcle1e5突变体的花序分生组织发育相对正常，但是显著增大，果穗显著增大，穗粒数增加，果穗形态正常，产量显著提升，且Zmcle1e5可显著增强Zmcle7突变表型，因此，ZmCLE1E5可部分互补ZmCLE7的功能。进而表明，同过对ZmCLE7互补因子的基因编辑，同样可以创制ZmCLE7启动子编辑类似的高产等位基因。玉米产量是极为复杂的数量性状，前人利用全基因组关联分析、连锁分析等手段，鉴定了数百个产量相关性状的QTL位点（www.maizegdb.org/qtl），其中大部分为微效QTL位点，且仅有少数位点被克隆，例如穗行数QTL位点KRN4，控制百粒重的QTL qHKW1、控制行粒数的KNR6等（Liu et al 2015; Yang et al 2019; Jia et al 2020）。这些QTL位点往往仅在一定的遗传背景下，才表现出较大的遗传效应，例如KRN4位点在H21背景下，可增加穗行数2.2行，而在Mo17背景下，其穗行数效应只有0.7行（Liu et al 2015）。另外，这些QTL位点的优良等位基因，往往在优良自交系群体中已被富集，进一步限制了这些位点在育种中的应用。而另外一方面，一些控制产量相关性状发育的关键基因，却不存在可导致表型数量变化的自然变异位点，一方面可能由于这些基因的优良自然变异位点本身就不存在，或者在驯化和改良中由于瓶颈效应丢失。例如，本研究涉及的两个CLAVATA3同源基因ZmCLE7和ZmFCP1，在具有广泛遗传变异的NAM群体里，并未检测到控制相关性状的QTL或关联位点（Brown et al 2011）。因此，该研究利用基因组编辑技术创制的ZmCLE7和ZmFCP1优良等位基因为新的基因资源。ZmCLE7和ZmFCP1调控区域编辑的优良等位基因，精细调控候选基因的表达水平，平衡其在花序发育中的功能，最终强化玉米产量性状表现，数量水平提高玉米籽粒产量，且它们的产量相关性状的效应，大于目前已克隆的任意QTL位点（Liu et al 2015; Yang et al 2019; Jia et al 2020）。除了启动子编辑策略，该研究还提出了对分生组织发育关键基因的互补基因进行编辑，也可优化分生组织活性，创制高产优良等位基因的策略。综上所述，该研究一方面创制了优良等位基因资源，另一方面，为重要基因的再利用提供了新的思路。
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论文链接：
www.nature.com/articles/s41477-021-00858-5
