食品微生物菌落总数、大肠菌群等标准解读
【食品论坛·大讲堂】食品中蛋白质检测
GB 4789.2-2016
食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定
01
稀释度的选择
液体样品可直接取原液进行检验；固体或者半固体则必须依据检验经验，选取2-3个适宜稀释度进行检验（一般样品选取1:10,1:100,1:1000三个稀释度进行检验。若遇到不常做的样品，可适当延长稀释度至1：10000甚至更大）。
02
空白实验
分别吸取1mL灭菌生理盐水到平皿中做空白对照，若空白有菌落生长则该实验无效。
03
培养基的倾注
根据对样品污染情况的估计，若样品有表面蔓延生长的可能性，则待第一次倾注的琼脂凝固后，可在表面再覆盖一层琼脂以避免菌落蔓延而难以计数。
04
菌落总数的计算
本标准的难点在于菌落计数及计算。
1）菌落计数时，从低稀释度的平板开始计数。若所有平板上的菌落数均小于30CFU，则需计数所有平板上的菌落数，但仅采用最接近30CFU的两个平板的菌落数来计算最终菌落数。
以固体样品为例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：
2）当第一稀释梯度一个板上菌落数高于30，另一个低于30，则依据标准应当以介于30-300之间的菌落数作为该稀释梯度的菌落数。
以固体样品为例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：
3）若所有平板上的菌落数均大于30CFU，则只计数30-300CFU之间的平板上的菌落数，并采用这些数据，依据标准中给出的公式，进行最终菌落总数的计算，此时将大于300CFU的记为“多不可计”，以TNTC表示。
以固体样品为例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：
4）若所有稀释度的平均菌落数都大于300，则不能所有都记为TNTC，必须将最高稀释度的两个平板上的菌落数逐一的计数，再计算平均数，该平均数为该梯度的菌落总数，其余平板上的菌落数可记为TNTC。
以固体样品为例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：
5）若所有平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数。
注意：最低稀释度的选择对结果存在较大的影响。如：某样品经多次检验后发现菌落总数较高，检验人员在梯度稀释后取1：1000，1:10000，1:100000三个梯度的稀释液倾注平板，最终所有平板上均无菌落生长，则计算结果为＜1000CFU/mL。若选取1：10，1:100，1:1000三个梯度的稀释液倾注平板，均无菌生长，则最终结果为＜10CFU/mL。
6）最低稀释度两个平板只有一个平板上长了1个菌落，若为固体样品且本次检验的最低稀释倍数为1:10，此时计算过称为(1+0)/2×10＝5，由于默认固体样品的最小检出量为10CFU，固本次检验的菌落总数结果为10CFU。
注意：对于该情况，一直存在争议，不同的检验人员可能做法不一，有人保留为5CFU，有人保留为10CFU，并无固定做法，建议实验室保持一贯做法，不要随意更改。
GB 4789.15-2016
食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数
1）孟加拉红培养基灭菌条件比较特殊：121℃，20min；
2）稀释液可选择生理盐水、硝酸盐缓冲液，还可以选择无菌水；
3）正置平板培养。未避免孢子扩散、菌落蔓延，可选择使用一次性塑料培养皿；
4）“观察并记录培养至第5d的结果”，意味着需要从培养的第二天开始逐日观察并记录霉菌和（或）酵母的生长情况，且原始记录须体现“逐日观察”；
5）特别注意："菌落数在10以内时，采用一位有效数字报告，菌落数在10-100之间时，采用两位有效数字报告"，即：在直接吸取原液检验时，若两个平板上的平均菌落数小于10，则四舍五入后的数值直接记为最终结果（不可四舍五入为10），若1:10的两个平板上一个长1个菌落，另一个无菌落生长，则平均数为0.5，最终计算结果为5，而不是10。
为防止孢子蔓延污染霉菌培养箱，可每周用75%酒精擦拭消毒两次或每次检出霉菌时用杀孢子剂消毒。
GB 4789.3-2016
食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数
第二法 平板计数法
常见问题汇总
01
VRBA培养相关问题
1）所用器皿是否需要灭菌？
不需要。配制培养基所用到的锥形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要灭菌。但必须清洗干净，表面无污渍、无残留。煮沸完成后，取下锥形瓶，用一般常用的软纸覆盖瓶口，并橡皮筋缠绕，待冷却至适宜温度后，即可倾注培养基。在倾注培养基时，须点燃酒精灯，稍微灼烧锥形瓶口。
2）如何保持“煮沸2min”？
可以用电磁炉或者电热板进行加热煮沸，在该培养基即将煮沸时调低温度。实际操作时，不需要严格按照此要求进行，加热煮沸数秒即可。因为本培养基很难保持煮沸2min，一旦煮沸，则培养基很快上涌、翻腾，若不调低问题或及时采取其它措施，则培养基很有可能在数秒内喷涌出来，严重者可喷涌2米以上、电磁炉周围1-2米范围内都是培养基飞溅的范围。
3）若培养基未用完，是否可以冷藏起来下次用？
不可以。4789.28中已规定，固体培养基最多允许熔融一次，并且特指经过高压霉菌冷却后的培养基还可以熔融一次后使用。且VRBA培养基冷却后，再次熔融后非常容易喷涌，若温度控制不当，底部培养基熔融后很快就会发生喷涌，即培养基未完全熔融就会发生喷涌现象。
4）倾注完成后是否需要“覆盖一层"?如何覆盖？
一般情况下不需要覆盖。在实际操作过程中，若检验员初次接触该样品类别，则因为不确定是否会发生菌落蔓延，所以有必要在倾注培养基的时候再覆盖一层，但如此反复多次测试后，若样品中不存在菌落蔓延情况，则以后的检验中都不需要进行覆盖。若重复多次测试后都有蔓延情况，则以后的检验中都需要覆盖，应该在原培养基已凝固或半凝固时再倾注一层培养基。
02
如何确定培养基上长得是不是大肠菌群？
建议新手们认真按照标准进行证实实验，此证实实验操作简单，每一次VRBA上有菌落生长都进行证实实验，如此往复3-4次，对于哪种形态才是大肠菌群均可了然于心。
03
两个梯度都涨了菌，如何选取？
选取15-150CFU之间的平板，挑选可疑菌落进行证实实验。举例如下：
若两个连续梯度的4个平板上都要挑取菌落进行证实实验，实际操作时，可灵活操作，如1:10的两个平板上的菌落数分别为120、123，1:100的两个平板的菌落数分别为16,18，严格来讲必须至少在每个平板上分别挑取10个可疑菌落和10个典型菌落进行证实实验，如此需要40根GBLB肉汤管。建议使用镍合金接种环，以为VRBA上生长的菌落大部分在底层、且菌落一般比较大，被培养基覆盖，传统的接种环较细，用以刮去上层培养基比较方便，挑取菌落也比较方便。
04
如何进行证实实验，菌落选取数量？
建议新手们VRBA上的所有不同形态的菌落都进行证实实验。每种不同形态都挑取5-10个进行证实实验（BGLB管足够，建议多挑选几个进行实验）。
注意：A. 每种可疑菌落挑取5个，每个菌落放入1根GBLB管中；B. “产气者，记为大肠菌群阳性管'’，就要求在实验前必须认真筛选BGLB管，凡产气的GBLB管应弃去不用。
05
结果如何计算？
首先，在VRBA培养24h后进行计数，分别计数可疑大肠菌群和典型大肠菌群的数量。假如在1:10的平板上的可疑大肠菌群有10个，典型大肠菌群有6个；然后进行证实实验，假如10个可疑大肠菌群中有3个证实为阳性，6个典型大肠菌群中有5个证实为阳性，则计算方法如下：最终大肠菌群数=经证实的大肠菌群数=可疑大肠菌群经证实的数量+典型大肠菌群经证实的数量=10×（3／10）×10+6×（5／6）×10＝80。
06
若平板上有很多菌落，最终证实全部为阴性，结果如何计算？
选取适宜菌落数的平板挑取菌落进行证实试验，若证实全部为阴性，则需要再挑取更低稀释度的平板上的菌落，建议可疑和典型菌落分别挑取10个进行验证试验，若第二次证实实验均呈阴性，以＜1乘以最低稀释度进行计算。