10条重要结论看双CD4-CAR-T细胞治疗HIV病毒的YES/NO丨研读
最近，美国麻省总医院、麻省理工学院、哈佛大学 Ragon 研究所和美国宾州大学佩雷尔曼医学院团队在 Nature medicine 上共同刊发了一篇名为 Dual CD4-based CAR T cells with distinct costimulatory domains mitigate HIV pathogenesis in vivo 的文章。文章介绍了一种新型的可同时表达 4-1BB/CD3-ζ和 CD28/CD3-ζ刺激域的双 CD4-CAR-T 细胞在人源化 HIV 感染小鼠模型上的试验结果，发现该双 CAR-T 细胞能增强治疗被 HIV 感染细胞的效力，可能成为治疗 HIV 感染的有效方法，并给出了 10 条重要结论。
（来源：SMART）
临床前研究显示，CD28/CD3-ζ共刺激的 CAR-T 细胞具有显著的效应器功能，能够快速清除肿瘤，但在体内的持久性有限；相比之下，4-1BB/CD3-ζ共刺激 CAR-T 细胞的抗肿瘤反应较慢，但能持续增殖和存活。CD28 和 4-1BB 所使用的不同的信号通路可引起不同的代谢、表型和功能性 T 细胞分化，为特定疾病诱导最佳的 CAR-T 细胞提供可能。
在该研究中，研究人员使用人源化小鼠模型进行了一系列试验，期望开发出一种基于 CD4 的 CAR-T 细胞来治疗 HIV 感染。为了增加效应器的功能，研究人员建立了一个双 CAR-T 细胞，它同时表达两个 CD4 为基础的 CAR，分别编码 4-1BB/CD3-ζ和 CD28/CD3-ζ内域。这些双 CAR-T 细胞表现出 CD28 共刺激 CAR-T 细胞的细胞毒性和细胞因子表达能力和 4-1BB 共刺激 CAR-T 细胞的增殖能力，表明这两种共刺激信号可同时起作用。研究人员也得出了如下 10 条重要结论：
1. 来自 BLT 人源化小鼠的 CAR-T 细胞具有多功能性，在体外可抑制 HIV 的复制。
BLT 是指骨髓（bone marrow，b）、肝脏（liver, l）和胸腺（thymus, t）。研究人员将人骨髓、肝组织和胸腺组织导入已无自身免疫系统的小鼠体内，构建出获得人类免疫系统特征的小鼠，它们被 HIV 感染的方式与人类一致。通过比较扩张动力学和比较 CAR 表面表达水平，发现来自 BLT 小鼠的 CD3-ζ内域（CAR.Tζ）细胞与来自人类的 CAR.ζT 细胞的体外功能特征没有明显区别，说明 BLT 小鼠可以制造出多功能的 CAR.ζT 细胞。
2. 共刺激调节 CAR-T 细胞可在体内持续存活和起作用。
研究人员将 CD3-ζ（CAR.ζ）、4-1BB/CD3-ζ(CAR.BBζ） 和 CD28/CD3-ζ（CAR.28ζ）T 细胞分别与一个不同的荧光蛋白相连，然后注入到小鼠体内。他们发现 4-1BB/CD3-ζ T 细胞在没有 HIV 抗原的情况下表现出最大的存活率，在组织中约占总 CAR-T 细胞的 80%，这与在癌症领域的研究结论一致。相比之下，CD28/CD3-ζT 细胞只表现出短暂的扩张，随后逐渐下降，而 CD3-ζT 细胞则稳定下降，没有扩张的迹象。通过向模型小鼠体内注入 CD19 特异性细胞，可以观察到血液中以及脾、肺、肝和骨髓中快速而严重的 B 细胞再生障碍，这与持续的 CAR-T 细胞毒性反应一致。这些数据共同证明了共刺激在一定程度上可调节 CAR-T 细胞的活性。
3. 4-1BB/CD3-ζT 细胞不能控制艾滋病病毒的反弹。
确定 4-1BB/CD3-ζ T 细胞在体内具有良好的扩增和持久性后，研究人员试图其在抗逆转录病毒疗法（ART）中抑制 HIV 感染的能力。研究人员使用 HIV 病毒感染 BLT 小鼠，并在 3 周后启动 ART。2 周后，将 ART 抑制小鼠分为 4 组，2 组接受 4-1BB/CD3-ζ T 细胞，其中 1 组在输注后立即停止 ART，另 1 组在 3 周后停止 ART；另外 2 组接受无活性的对照 4-1BB/CD3-ζ T 细胞，其中 1 组在输注后立即停止 ART，另 1 组在 3 周后停止 ART。结果显示，4 组均表现为 ART 治疗被中断 2 周后病毒出现反弹，并且严重程度上没有明显的差异。而且 4-1BB/CD3-ζT 细胞疗法不能防止外周血或组织中的记忆性 CD4+T 细胞被 HIV 感染和耗尽。这些数据表明 4-1BB/CD3-ζT 细胞治疗不能抑制 HIV 的增殖进展。
4. 4-1BB/CD3-ζT 细胞在 HIV 大量复制过程中表现出 T 细胞衰竭特征。
研究人员观察到 4-1BB/CD3-ζT 细胞在病毒复发期间扩增，血液中的浓度平均增加了 75 倍，而对照组的 T 细胞没有在病毒反弹后出现扩张。在输注 12 周后，4-1BB/CD3-ζT 细胞在全身的分布更多。这些发现表明，4-1BB/CD3-ζT 细胞控制病毒血症和 HIV 发病的效果不佳并不是由其增殖不良、持久性差或缺乏迁移到病毒复制相关部位所致。4-1BB/CD3-ζT 细胞的扩散与包括 PD-1、TIGIT 和 2B4 在内的抑制性受体上调有关，这些受体含量随 ART 停止时间增加而增加。重要的是，这些抑制性受体在同一小鼠的内源性 CAR−T 细胞上的表达程度不同，这表明 CAR-T 细胞具有特异性效应，而不是由炎症或病毒载量导致的普遍性激活。随着 HIV 感染的进展，4-1BB/CD3-ζT 细胞逐渐减少，最终形成了功能失调的 HIV 特异性 CD8+T 细胞，这与已有的研究发现一致。综合显示，4-1BB/CD3-ζT 细胞能够识别被 HIV 感染的细胞，迅速扩张并上调细胞激活的标记物，但不受控制的病毒复制最终会耗尽这一程序，这可能会降低 T 细胞的功效。
5. 增强型双 CAR-T 细胞可减少急性感染时 CD4+T 细胞的丢失。
研究人员创造了一种以 CD4 为基础，且含有 CD28 共刺激域的 4-1BB/CD3-ζ新型双 CAR-T 细胞（Dual-CAR-T cells）。加入 CD28 共刺激域可增加 4-1BB/CD3-ζT 细胞在体外生成细胞因子的量。使用被 HIV 病毒激发 48 小时的小鼠模型来检测治疗效果，发现尽管双 CAR-T 细胞治疗组和未治疗组之间的急性病毒血症没有表现出差异，但是接受双 CAR-T 细胞治疗的小鼠在外周记忆 CD4+T 细胞（即 CAR-）丧失方面表现出显著的（尽管是短暂的）延迟，这与外周血中总 CAR-T 细胞的峰值扩张相一致。值得注意的是，在接受 4-1BB/CD3-ζT 细胞治疗的小鼠停止 ART 治疗后，并没有在中枢、过渡性和效应记忆亚群中观察到 CD4+T 细胞丧失延迟现象。CD4+T 细胞的保存在过渡期和效应记忆人群中尤为突出，效应记忆人群表达更高水平的 CCR5，而 CCR5 是是 HIV-1 入侵机体细胞的主要辅助受体之一。双 CAR-T 细胞治疗可以有效地限制 HIV 导致的记忆性 CD4+T 细胞的耗竭。
图 | 双 CAR-T 细胞结构示意（图右）（来源：Nature medicine 2020）
6. 双 CAR-T 细胞在竞争环境中表现出旺盛的增殖能力。
通过将每个 CAR 与一个独特的荧光蛋白连接，可以实现每种 CAR-T 细胞类型独立的量化。研究人员发现相对于表达单一共刺激域的 CAR-T 细胞，双 CAR-T 细胞在体内有更高的扩增。研究人员将等量的双 CAR-T 细胞和第三代 CAR-T 细胞分别注入到受体小鼠中，发现双 CAR-T 细胞明显表现出更强的抗原独立性植入和优越的抗原驱动增殖。相比之下，第三代 CAR-T 细胞略有扩张，然后逐渐下降。并且研究人员观察到，与第三代 CAR-T 细胞相比，双 CAR-T 细胞在同一小鼠体内表现出了更高的增殖和长期存活。这些研究揭示了双 CAR-T 细胞在抗原稀缺和丰富的体内竞争环境下均表现出惊人的增殖能力。
7. HIV 融合抑制剂 C34-CXCR4 可以保护 CAR-T 细胞免受 HIV 感染。
尽管基于 CD4 的 CAR 与其他几种基于 HIV 特异性抗体的 CAR 相比，能够更有效地抑制体外 HIV 复制，并且能降低病毒逃逸的可能性，但这种基于 CD4 的 CAR 导致了 T 细胞表面 CD4 胞外结构域的过度表达，从而也增加了易感性。事实上，在体内检测到被 HIV 感染的 CAR-T 细胞由于与内源性 CAR-T 细胞无法区分所以无法判定总感染数。研究人员使用在表面表达的 HIV 融合抑制剂 C34-CXCR4 来处理双 CAR-T 细胞，使之获得抗 HIV 的能力。试验结果显示，C34-CXCR4 融合抑制剂可以保护 CD4-CAR-T 细胞免受 HIV 感染，并且在持续暴露于 HIV 时, 仍可以保持 CAR-T 细胞的功能。
8. 抗 HIV 双 CAR-T 细胞可减轻 HIV 导致的 CD4+T 细胞减少。
为了确定在 HIV 感染期间双 CAR-T 细胞的注入是否表现出增强的病毒特异性反应，研究人员向 HIV 感染小鼠体内注入了低剂量的 C34-CXCR4+、纯化的双 CAR-T 细胞、4-1BB/CD3-ζT 细胞或 CD28/CD3-ζT 细胞，并分为不同组。结果显示，双 CAR-T 细胞显示出对急性病毒复制的显著敏感性，在感染后 3 周内，其扩增倍数为 300 倍，占血液中人类细胞总数的 30%，而 4-1BB/CD3-ζT 细胞和 CD28/CD3-ζT 细胞分别只有 3% 和 1%。在 HIV 病毒感染期间，输注纯化的双 CAR-T 细胞可最大程度地防止 CD4+T 细胞减少。此外，所有组的早期 CAR-T 细胞扩张的幅度与 CD4+T 细胞的保存呈正相关。这些数据表明，在控制 CAR 表面表达后，双 CAR- T 细胞显示出最大的体内抗病毒作用。
9. 双 CAR-T 细胞体外效应功能强过单一的 4-1BB 共刺激 CAR-T 细胞。
研究发现，双 CAR 和 CD28 共刺激的 CAR-T 细胞以相似的方式聚集在一起，CD4 + 的 CAR-T 细胞表达更多的 TNF 和 IL-2，CD8 + 的 CAR-T 细胞上调更多的 CD107a 和 MIP-1β效应分子。相反，CD4 + 和 CD8+4-1BB 共刺激的 CAR T 细胞聚集在一起，并显示出减弱的效应分子水平。这些试验结果显示，双 CAR-T 细胞分别利用抗原驱动的增殖和 4-1BB 和 CD28 共刺激域介导的效应器功能来提高效力。
10. 保护 CAR-T 细胞不受 HIV 感染可增强其对病毒复制的控制能力。
研究人员比较了完全保护和部分保护的双 CAR-TCP 输注到 HIV 感染、ART 抑制的小鼠体内，然后停止 ART。结果显示，输注部分保护的双 CAR-T 小鼠的反弹后血液病毒浓度高于未受治疗的小鼠血液病毒浓度，更高于输注完全保护的双 CAR-T 的小鼠血液病毒浓度。试验数据表明了保护 CAR-T 细胞的重要性，因为 HIV 感染未受保护的 CAR-T 细胞可能导致血浆病毒血症，并可能压倒 CAR-T 细胞介导的对病毒复制的控制。虽然 C34-CXCR4 减少了 HIV 病毒对 CAR-T 细胞的感染，但试验已经证明，这种保护在持续病毒血症存在时不能起效。研究人员尝试使用 ART 和双 CAR-T 细胞联合治疗，一周后显示联合治疗的小鼠比纯 ART 对照组的病毒载量减少了大约 1 个对数，这对应于预处理水平的病毒血症减少了 50%。两项研究的数据汇总表明，早期病毒载量减少的程度与同时期外周血中 CAR-T 细胞的浓度有关，并且 CAR-T 细胞治疗显著加速了 HIV 抑制，与 ART 治疗对照组相比，几乎所有接受联合治疗的小鼠在治疗开始 2 周后达到完全抑制 HIV。此外，双 CAR-T 降低了血浆病毒血症小鼠的组织负担，组织中感染 HIV 的 CD8-T 细胞（CAR-）和 CD14 + 巨噬细胞均减少。值得注意的是，与对照组相比，从用双 CAR-T 细胞处理的小鼠中分类的中央记忆 CD4+T 细胞显示出 HIV 相关的细胞 DNA 负载显著减少，这表明 CAR-T 细胞疗法能够减少 ART 期间形成的病毒库的大小。
这些发现突出了抗 HIV 双 CAR-T 细胞在体内直接介导抗病毒和清除感染细胞的潜力。
责任编辑：余小飞
参考：
https://baijiahao.baidu.com/s?id=1676056187120994691&wfr=spider&for=pc
https://www.lifeomics.com/?p=26525
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