做PCR实验你遇到过这些问题吗？前辈的经验分享

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。你在做PCR实验的时候遇到过哪些问题？看看前辈们的经验对你有帮助吗？

没有ct值

检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:

1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);
2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;
3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;
4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可),对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;
5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。

标准曲线不佳

标准曲线线性关系不佳R2<0.9,很有可能是以下环节存在问题:

1、标准品稀释或者加样误差,使得标准品不呈梯度;

2、标准品出现降解。应避免标准品反复冻融,将高浓度DNA模板分装,保存于-20℃或-80℃,现配现用;

3、引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或探针;

4、模板中存在抑制物。模板浓度过高,根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求,一般模板量以50—500ng为宜。

ct值过晚

在相对定量中,Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中,对低拷贝数的样品,Ct值会增大,但是一般不宜超过40循环,否则定量不准确。因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况,需要根据具体实验设计和目的进行。

1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适,需要进行优化;引物或探针设计不合理,需要重新设计;
2、PCR程序不合适,改用三步法进行反应,或者优化退火/延伸温度,可以适当降低退火温度;退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);
3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;
4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;
5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。

熔解曲线峰不特异

熔解曲线峰不特异很有可能是以下环节存在问题:

1、引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现;引物浓度不佳,尤其是涉及二聚体存在时,适当降低引物浓度,并注意上下游引物的浓度比例;

2、模板有基因组污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异性扩增。

3、离子浓度不合适。适当降低镁离子浓度,或选择更适合的mix试剂盒,不同试剂盒在该方面的优化能力不适合,有些情况下可以通过更换试剂盒改善结果;

阴性对照扩增有信号

照扩增有信号排查各操作环节是否有不当,造成交叉污染:

1、引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

2、引物浓度不佳。适当降低引物浓度,并注意上下游引物的浓度配比。

3、镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度,或选择更适合的mix试剂盒。

4、模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异性扩增。

5、交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染,或操作环境中有气溶胶造成污染,建议对操作环境进行处理,或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。

扩增曲线异常

遇到扩增曲线异常,比如“S”型曲线等等情况,有可能是以下环节存在问题:

1、模板的浓度太高或者降解;
2、荧光染料的降解;
3、在操作荧光定量PCR时,带上新的一次性手套,盖上避免任何指纹或者字迹等;
4、液体挥发。耗材气密性等问题引起液体蒸发,没有很好的聚集在管子里;

5、气泡。操作问题如移液枪加样引起的气泡问题。

扩增效率低

该情况适用于针对所有的基因,特别是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时,应考虑如下情况:

1、反应试剂中部分成分比例是否最佳,另外考虑荧光染料是否降解;

2、反应条件不够优化。可适当降低退火温度或改为三步扩增法,适当延长变性退火时间;

3、反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板时所引入的,应先把模板适度稀释,再加入反应体系,减少抑制物的影响。

（内容来源:临床实验室 由小析姐整理编辑）