Tom20感知铁激活的活性氧信号促进黑色素瘤细胞焦亡
研究背景：黑色素瘤是最具侵袭性的人类癌症之一。由于遗传或表观遗传的改变，黑色素瘤细胞对凋亡诱导具有抗性。因此，开发黑色素瘤治疗的新策略非常重要。
铁已被证明通过提高活性氧(ROS)来触发氧化应激，并参与不同模式的细胞死亡，如铁死亡、凋亡和坏死。铁蛋白的破坏导致活性氧的升高和细胞死亡，呈铁依赖性。由于铁在氧化应激升高中的重要作用，靶向铁已成为一种潜在的癌症治疗。然而，铁诱导的活性氧促进细胞死亡的机制仍不明确。
细胞焦亡是一种由炎症体引发的裂解性程序性细胞死亡形式，炎症体激活半胱天冬酶-1或半胱天冬酶-11/4/5来切割gasdermin D (GSDMD)。
尽管众所周知的细胞焦亡在免疫细胞中的抗感染作用，焦亡的诱导是否可用于癌症治疗仍不清楚。
而本研究表明铁诱导的细胞焦亡可能是一种新的、有前途的黑色素瘤临床治疗策略
为了证实FTH1-或FTL敲除A375细胞中细胞焦亡对内源性铁的需求，研究者在CCCP刺激之前用去铁胺预处理细胞。发现了内源性铁参与了CCCP诱导的细胞焦亡。为了进一步确定了这种CCCP诱发的细胞焦亡是否与铁超载直接相关。研究者将没有敲除FTH1或FTLA375的细胞用CCCP加外源性铁处理。发现与单独的CCCP治疗相比，CCCP/铁的联合治疗显示出更明显的细胞存活抑制，伴随有显著的细胞焦亡和乳酸脱氢酶释放(图1a)。值得注意的是：外源性铁对LDH释放和细胞死亡的影响在FTH1-或FTLknockdown A375细胞中更明显(图1b)。这表明在CCCP存在的情况下，阻断铁蛋白将促进铁发挥其驱动黑色素瘤细胞焦亡的功能。接着研究者调查了GSDMD和GSDME是否与CCCP/铁诱导的细胞焦亡有关。发现在CCCP/铁病例中存在依赖于二甲基亚砜的细胞焦亡。接着研究者又发现在CCCP存在情况下，在A375细胞中，Fe2(SO4)3也能像FeSO4一样有效地诱导细胞焦亡、GSDME裂解和LDH释放。最后作者通过一系列检测得到的数据证实了细胞焦亡和细胞凋亡有许多共同的上游调节因子，而且暗示了通过降低GSDME的表达来抑制细胞焦亡可能将细胞焦亡转变为细胞凋亡。
以上结果表明：铁增强活性氧来诱导黑色素瘤细胞焦亡。
图1
接着研究者测试了线粒体是否是CCCP/铁诱导的细胞焦亡所必需的，发现在A375细胞中，由于缺乏Parkin表达，CCCP处理未能触发有丝分裂。为了消除线粒体，用Parkin转染A375细胞并对其进行短期CCCP处理以进行广泛的有丝分裂诱导。在这些细胞中，可地观察到由线粒体与LC3的共定位所指示的有丝分裂以及线粒体蛋白质或线粒体DNA。在这种情况下，几乎检测不到CCCP/铁诱导的细胞焦亡特征(图2a)。因此，CCCP/铁诱导的细胞焦亡可能与线粒体途径有关。此外，CCCP单独处理可导致A375细胞中正常的管状线粒体网络断裂成短杆状或球状(图2b)，且铁与CCCP联合处理诱导了线粒体片段的聚集(图2b)，表明此过程需要活性氧。又发现细胞色素c释放到胞质溶胶是以活性氧依赖的方式响应CCCP/铁刺激(图2c，d)。因此，CCCP/铁有效地诱导半胱天冬酶-9和-3的裂解，且这也被NAC或谷胱甘肽孵育阻断(图2e)。此外，在A375细胞中铁蛋白被FTL或FTH1敲除破坏后，胱天蛋白酶-9和-3的切割通过CCCP/铁处理进一步增强(图2f)。
以上结果表明：铁诱导的细胞焦亡与线粒体途径有关。铁放大的ROS信号可能作为促进线粒体聚集和随后的细胞色素c释放的上游因子发挥作用。
图2
Tom20和Tom40的蛋白质水平，被CCCP/铁以时间依赖的方式显著增加(图3a)。仅CCCP处理就足以诱导Tom40积累，这与研究者以前的报告一致。然而，Tom20积累只能在CCCP/铁的联合处理后检测到(图3a)。接着又进一步研究了Tom20或Tom40的积累是否与CCCP/铁诱导的细胞焦亡有关。敲除Tom20在CCCP/铁刺激下明显增加A375细胞的细胞存活力(图3b)，同时抑制GSDME切割、LDH释放和细胞肿胀(图3c)。相比之下，敲除Tom40对细胞死亡和细胞焦亡特性都没有影响。表这明Tom20参与了铁诱导的细胞焦亡。接着又在Tom20-或Tom40knockdown细胞中进一步分析了铁诱导的细胞焦亡中上游和下游调节因子的关系。发现Tom20或Tom40的敲除不能影响CCCP/铁诱导的活性氧升高。相反，CCCP/铁诱导的Tom20积累被活性氧清除剂NAC和GSH消除。
以上结果表明：Tom20感知ROS信号并将其给传递线粒体。Tom20是ROS的一种新的下游因子，可感知铁增强的ROS信号，并将该信号传递给线粒体以诱导细胞色素c的释放，最终通过胱天蛋白酶-3对GSDME的切割诱导细胞焦亡。
图3
接着研究者进行了非还原条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳。在对CCCP/铁刺激的反应中，在高分子量复合物中清楚地检测到Tom20，该复合物被NAC处理所消除(图4a）。表明铁诱导的活性氧可能通过氧化Tom20形成分子间二硫键而导致Tom20寡聚化。又在A375细胞中，转染Tom20C21S或Tom20C21S，发现显著消除了CCCP/铁诱导的Tom20寡聚化（图4b），表明Cys13和Cys21都是Tom20分子中分子间二硫键形成所必需的。因此，铁增强的活性氧导致Tom20在Cys13和Cys21氧化，这与Tom20的低聚和积累有关。为了进一步验证氧化在Tom20相关功能中的作用，研究者将Tom20WT、Tom20C21S和Tom20C21S的siRNA以抗性形式分别引入Tom20knockdown A375细胞。发现铁诱导的线粒体聚集、细胞色素c释放和半胱天冬酶-3/9的切割只能在Tom20WT-中检测到，而在Tom20C13S-或Tom 20C21S-表达细胞中检测不到(图4d–f)。表明通过Tom20的C13S或C21S突变，焦磷酸特征，如LDH释放、细胞肿胀和细胞死亡被减弱(图4g，h)。
以上结果表明：ROS诱导的Tom20氧化促进细胞焦亡。
图4
由于Tom复合物对Bax线粒体定位诱导细胞色素c释放很重要。因此研究者研究了Bax是否通过Tom20调节参与铁诱导的细胞焦亡。发现CCCP/铁处理清楚地诱导了Bax从细胞质向线粒体的易位(图5a，b)，这可被Tom20敲除所消除(图5b)，表明了对CCCP/铁的反应中Bax的Tom20依赖性线粒体定位。值得注意的是，Bax的敲除不仅消除了CCCP/铁诱导的线粒体聚集(图5c)、细胞色素c向胞质溶胶的释放(图5d)和半胱天冬酶-3/9切割(图5e)，而且抑制了黑色素瘤细胞死亡(图5f)和细胞焦亡(图5g)。显然，Bax可能通过Tom20对铁诱导的细胞焦亡是必需的。CCCP/铁处理后，Tom20和Bax之间的相互作用显著增强。最后研究者还测试Tom20氧化是否也参与其他线粒体介导的细胞死亡途径，发现Tom20氧化也可能适用于其他线粒体介导的细胞焦亡。
以上结果表明：铁诱导的Tom20氧化促进Bax向线粒体的募集。促进了Bax依赖性细胞色素c的释放，并导致黑色素瘤细胞的焦性死亡。
图5
前面已经确定铁放大ROS信号以诱导细胞焦亡，研究者进一步研究了铁是否可以使黑色素瘤细胞对激活ROS的药物敏感。
大量临床使用激活ROS的药物分别治疗有或没有铁联合治疗的黑色素瘤细胞得到的数据表明：虽这些药物没有一种单独诱导细胞焦亡，但铁的协同处理显著促进了细胞焦亡，如LDH释放、GSDME裂解和细胞肿胀所揭示的(图6a）。接着研究者对SSZ和BSO在A375细胞中进行更详细的分析。
得出的结果进一步排除了铁死亡与SSZ/铁或BSO/铁引发的细胞死亡的关系。
以上结果表明：铁提高了由不同药物诱导的ROS以引发细胞焦亡
图6
为了进一步测试铁在体内对SSZ的增敏作用，研究者将具有A375细胞驱动的异种移植肿瘤的裸鼠单独或与不同剂量的铁右旋糖酐溶液(铁右旋糖酐，人类治疗缺铁的常用药物)联合腹膜内给药。发现铁与临床药物发挥协同作用，抑制肿瘤生长。为了测试铁/SSZ的抗肿瘤作用是否与焦磷酸酯酶病有关，研究者分别用A375细胞和GSDME被敲除的A375细胞在裸鼠体内产生异种移植瘤。发现与对照PBS组(图7d)相比，SSZ/碘共处理显著降低了A375细胞驱动的肿瘤生长(图7c)，且伴随着GSDME切割的增加。然而，在GSDME被敲除后，注射具有ID的SSZ不能再抑制异种移植肿瘤的生长(图7c)。表明铁通过GSDME和细胞焦亡介导的途径使黑色素瘤细胞对ROS诱导的药物治疗过敏。
以上结果表明：铁抑制小鼠模型黑色素瘤发展中的生理作用。
图7
图8铁刺激下Tom20-Bax-caspase-GSDME的新通路
总结：本研究不仅确定了铁是一种敏化剂，可以放大ROS信号，从而驱动焦磷酸症，而且还暗示了一种新的基于铁的黑色素瘤治疗干预策略。
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