活体成像拍照&图像分析实用技巧

Section 1  成像

光学活体成像，与其他光学成像拍摄基本一致，最终图像的呈现效果取决于四个参数。

在Living Image软件的控制面板上，主要的拍摄参数包括曝光时间(exposure time)、像素合并（Binning）、光圈(f/stop)和视野Field of View (FOV)，其中前三项对拍摄敏感度起到了绝对的控制。

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曝光时间

曝光时间和快门打开的时间成正比，决定了信号强度的高低。当光信号较弱时，可以通过延长曝光时间来增加信号强度。推荐曝光时间，最短＞0.5秒，最长＜5分钟。

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光圈

光圈控制采集光的量，f/stop分母的数值越低，代表光圈打开的越大。f/1时光栅全部打开, 表示最多的光通过，通常作为生物发光的默认设置；f/8时光栅最小, 此时分辨率达到最高，作为photograph的默认设置。

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像素合并

Binning指组合像素成为一个大的感光单元。当光强度较弱时，我们往往通过增加Binning值来获取更高的灵敏度，但灵敏度的增加则意味着分辨率的下降。

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视野

视野取决于镜头和样品的距离。载台位于D位置时，可以同时获取5只小鼠的成像图片；载台位于A位置时，只能获取一只小鼠的一个局部照片。不同视野的选取意味着不同的放大倍数。

Section 2  图像分析

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定量

在获得了理想的活体成像图片之后，接下来我们就需要对每只实验动物的光信号进行比较分析，这时我们通常要用到定量工具。

我们可以利用各种图形对光信号进行圈选，然后进行定量计算。但这时，我们需要注意一点，就是光信号单位。在Living Image软件中，光的原始单位是counts，但是原始单位会受到拍照参数的影响而无法进行相互比较。

如上图所示，同一信号源，当光圈大小，像素合并都相同的情况下，利用原始单位counts定量出来的信号强度，与曝光时间成正比关系。因此为了避免拍照参数不同对图像分析造成影响，软件中将原始单位进行了校正，我们称之为绝对定量单位。仍以上图为例，利用绝对定量单位进行定量比较时，同一信号源经过不同参数的拍照，仍然可以得到唯一的定量结果。

以一个实例来说明绝对定量单位的必要性：

在连续6天的成像过程中，由于每次的拍照参数不同，如果使用原始单位进行定量比较，得到的结果不存在规律性的变化趋势。

改用绝对定量单位进行处理之后，由于排除了拍照参数的影响，光信号无论是从图像上还是从线性曲线上，都能观察到明显的变化规律。

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图像处理

对于多个单张结果图，有时需要放在一起，即放在一个标尺中比较，这样可以保证每个图中的信号值范围一致，比较才有意义。下面介绍将多个结果图放在同一个标尺下的处理方法。

首先通过Browse 按钮打开所要浏览的图片，同时选择需要放置在一起的几张图，这时所选图片会以灰色表示已选，之后点击Load as Group 按钮将所选图片以组图形式呈现。

调出图片后，第一步仍然是修改光信号单位为绝对定量单位，以便于后期比较。注：生物发光单位为Radiance（Photons）；荧光单位为Radiant Efficiency。

在上面的结果图中两张图片虽然显示在了一起，但是单张图片仍然以各自的标尺显示。这时，在右边工具栏的Image Adjust工具条中，可以发现有一个Individual选项是被勾选的，去掉勾选后，标尺将显示出来（如下图），通过调节Aggregate Color Scale中的Min值和Max值，改变图中表示出的信号范围，就可以对不同动物间光强度进行比较了。

参考资料

www.perkinelmer.com/LivingImage-UserGuide（Simplified version）

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