二代测序 上机篇

写在前面：

本次更新主要介绍不同平台的测序仪和一些测序的原理等。

1、不同平台测序仪器和其相关参数：

1）Illumina平台[1]

2） Thermo Fisher 平台[2]

3）华大平台[3]

2、测序流程&原理（Illumina平台）：

1）文库装载 & “长”在芯片上

上机测序的第一步就是要把文库装载到芯片上，这其中也涉及到文库稀释和多个文库pooling的操作，芯片的结构如图1所示，每条lane上都有很多小孔，每个孔里都“长”有寡聚核苷酸，这些寡聚核苷酸可以跟文库接头末端互补配对，使得文库“长”在芯片上。

图1 芯片接头示意图

2）桥式扩增 & 成簇

当文库“长”在芯片上后，文库会通过桥式扩增的形式形成簇（图2），这也就是我们常在仪器运行界面看到的簇密度。

图2 簇形成过程

3）测序

①单端测序。

Read1→index→Read2

图3 单Index测序

②双端测序。

Read1→i7 Index→i5 Index →Read2

图4 双Index测序

4）碱基识别

Illumina平台测序是边合成边测序的原理。主要是借助荧光标记dNTP（A、T、C、G），这种dNTP的3’末端是一个叠氮基团封住的，依据碱基互补配对，当互补的dNTP结合到链上后，仪器清洗掉其他多余dNTP，由于3’端是封住的，所以延伸停留在该步骤，当识别该位置荧光信号后，切掉3’端叠氮基团，再加入新的聚合酶和dNTP，进行下一轮循环。通过多轮循环，完成碱基识别。

HiSeq & MiSeq 为4种荧光标记，即：

NextSeq & MiniSeq & NovaSeq 为2种荧光标记，即：

只出现绿色信号为T碱基；

只出现红色信号为C碱基；

同时出现红绿（橙色）信号为A碱基；

同时都没有信号为G碱基。

最后比较特殊的是iSeq100的一种荧光信号，但会捕捉两次成像，即：

当第一次和第二次都捕捉到荧光信号则为T碱基；

当第一次捕捉到荧光信号，第二次信号消失则为A碱基；

当第一次没有信号，第二次出现荧光信号为C碱基；

当两次均未出现荧光信号则为G碱基。

后续：

本来这篇内容是五一前要发的，因为工作的一些事情耽搁了。先写这么多吧，后续会继续写完这部分。其次原理部分也要感谢工作中Illumina技术的支持。

[1]https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms.html#f0594470-b927-4912-99b4-fd575ba1c813-tab2.

[2]https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-run-sequence.html.html.

[3]https://www.mgi-tech.com/products/.