JTO：日本非吸烟患者基因组综合分析
今天给大家带来的是2020年2月发表在J Thorac Oncol （12.46）杂志上的文章“Identification of Novel CD74-NRG2α Fusion From Comprehensive Profiling of Lung Adenocarcinoma in Japanese Never or Light Smokers”。在这篇文章中作者通过全转录组测序与外显子测序的方法，在日本不或轻度吸烟者LUAD中新型CD74-NRG2α融合蛋白，同时作者还发现日本不或轻度吸烟者LUAD的拷贝数变异与突变特征。作者还构建了一个由3个基因组成的LUAD预后模型。
Identification of Novel CD74-NRG2α Fusion From Comprehensive Profiling of Lung Adenocarcinoma in Japanese Never or Light Smokers从日本未吸烟者和轻度吸烟者的肺腺癌综合概况中鉴定新型CD74-NRG2α融合蛋白
以后我们公众号的文献解读尽量都会让小编附上视频讲解，希望大家能够喜欢。btw，虾饺皇小编第一次录制视频，有点小紧张，希望大家理解；我们会越做越好的。
一.研究背景
在全球范围内每年有超过百万人因肺癌死亡，而在肺癌中，最常见的类型为肺腺癌（LUAD），目前酪氨酸激酶（RTK）靶向疗法在相应的激酶基因激活的LUAD中效果较好，现在针对KRAS、ERBB2、BRAF、MET、RET、NTRK1和NTRK等基因的靶向疗法的研究也在进行中。
二.分析流程
三.结果解读
1.对不或轻度吸烟者的肺腺癌（LUAD）进行全转录组测序和全外显子测序发现存在未知的驱动癌基因
图1A：对日本队列996例原位LUAD（373 例重度吸烟、例104 轻度吸烟、 510例不吸烟和9例未知吸烟史）通过PCR clamp 、FISH等方法进行驱动癌基因检测，其中有435例EGFR突变、121例KRAS突变、 22例ALK融合、10例RET融合和10例ROS1融合。KRAS和G12C在重度吸烟者中占比较大。389位患者上述所有的突变都为阴性，其中有201位患者不或轻度吸烟。
图1B：对124例不或轻度吸烟LUAD、1例重度吸烟LUAD（对照）和1例重度吸烟LUSC（对照）进行全转录组测序，发现有26例EGFR罕见突变、16例ERBB2突变、17例BRAF突变、8例MAP2K1突变和3例NRG1融合。对上述124例不或轻度吸烟LUAD中的83例进行全外显子测序，发现13例MET外显子14跳跃（ 通过split reads验证了MET外显子13与外显子15连接）；每一例都有EGFR、ERBB2、MET和MAP2K1过表达；和此前未被发现的1例CD74-NRG2融合体和1例FGFR2-MBIP融合体
图1C：外显子测序发现的CD74-NRG2融合体，CD74-NRG2的NRG2的转录本变体为NRG2α；EGF基序由NRG2α的外显子4和外显子5编码，被包含在CD74-NRG2α融合物中
图1D：NRG1融合的转录变体。外显子En代表NRG1β的下游外显子，外显子TMc为外显子α和外显子En的下游外显子。NRG1融合由NRG1α和NRG1β在内的不同转录变体组成
因此，125例LUAD中有88例被鉴定出驱动癌基因
图1. 发现位置的驱动癌基因
2.NRG1 / 2-融合阳性LUAD的临床病理特征
表1：作者展示了4例NRG1 / 2-融合阳性患者的临床信息，均为60-70岁女性，并进行了手术切除。CD74-NRG2α阳性患者接受erlotinib（埃罗替尼）治疗并且在停药一个月患有皮疹
图1E：展示了NRG1 / 2患者的组织切片，CD74-NRG2α阳性LUAD的组织分型为腺泡腺癌，由圆形到椭圆形的非典型腺体组成；CD74-NRG1阳性LUAD的组织学分型为浸润性黏液腺癌，由胞浆内具有丰富黏蛋白和基底取向核的柱状细胞组成；SDC4-NRG1阳性为实体腺癌，主要由构成薄片样的多边形肿瘤细胞组成。同时，作者对肿瘤细胞进行了NRG1融合蛋白下游激活信号p-EGFR和p-HER2/3/4的免疫组化分析，CD74-NRG2α阳性病例中p-HER4呈弱阳性，p-EGFR、p-HER2和p-HER3阴性；NRG1融合阳性病例中所有HER家族阳性。
表1. NRG1 / 2-融合阳性患者的临床信息
3.不或轻度吸烟者LUAD中的突变特征与拷贝数分析
图S4AB：使用 Wellcome Trust Sanger Institute Mutational Signature Framework，发现4个COSMIC突变特征与LUAD显著相关
图S4C：展示四个突变特征情况在83个外显子测序中的情况
图S4D：展示了染色体拷贝数扩增情况，其中chr1q、chr5p（包括TERT基因座）、chr7p（EGFR）、chr8q（MYC）、chr12（MDM2）、chr16p、chr17q（ERBB2）和chr20q扩增，而chr9和chr17拷贝数丢失
图S4. 突变特征与拷贝数变化
4.通过NGS分析检测驱动癌基因的体细胞突变
图S7A：作者发现7个MAP2K1突变的病例情况：p.Glu102_Ile103del和p.P105_A106del
图S7B：通过TaqMan单核苷酸多态性基因分型分析该队列其他患者的MAP2K1突变发现在有两例不或轻度吸烟患者存在p.P105_A106del，而重度患者没有
图S7. 检测到MAP2K1突变
同时，作者通过在细胞中转染MAP2K1与上述突变体进行细胞学验证
图S8A：发现MAP2K1转染无转化的病灶，而突变体转染形成病灶，进一步通过WB验证了突变体能增强激酶活性
图S8B：通过转染IL-3依赖型细胞进一步验证，发现没有IL-3转染突变体人仍能生长，而MAP2K1则不可生长，同时使用曲美替尼抑制，发现只有突变体被抑制生长
图S8C：在裸鼠中注射各个细胞，发现突变体可以形成肿瘤且肿瘤可被曲美替尼抑制
图S8. MAP2K1突变的细胞学验证
5.LUAD的全转录组分析
图2A：对样本中变异程度最大的前100个基因，通过k均值聚类分析将队列分为两簇
图2B：将临床信息、变谱与基因表达数据进行了综合分析并使用Fisher检验，发现基因簇1（图2A左边部分）癌症高阶段的患者比例低于基因簇2
图2C：对两个基因簇进行生存分析，发现基因簇1的OS和RFS优于基因簇2
图S9：通过GSEA分析，发现E2F_TARGETS基因集富集于基因簇2
图2. 对变异程度大的基因进行分类
作者随后通过对13,000多个基因进行单变量Cox分析，得到192个基因与OS显著相关。随后筛选出14个假阳性率≤0.03的基因，并通过前向条件逐步回归与多变量Cox分析构建预后模型，最终得到构建预后模型的三个基因CCL8，MIS18A和C1orf131，公式为：
（n为预后基因数量，expi为表达等级，βi是基因i的回归系数）
图3A：使用预后模型预测队列的风险评分，并通过手动设置75%为阈值分成高风险组和低风险组
图3B：对高风险组与低风险组进行生存分析，在癌症所有阶段低风险组OS与RFS优于高风险组
图3C：分析LUAD患者基因表达情况，并鉴定出高风险评分中高表达的前100个基因和低表达的前100个基因
图3D：GSEA分析高风险组与低风险组，发现E2F靶基因、MYC靶基因和G2M检查点在高风险组处富集
图3. 预后模型的构建与验证
表2：通过多变量分析验证预后模型，发现在改变EGFR和ALK状态，风险评分仍有意义
表2. 多变量分析验证预后模型
图4A：展示各个组织亚型LUAD中驱动癌基因突变的人数，发现共有679名患者被证明有驱动癌基因，且突变分布在所有肺癌组织学亚型中
图4B：对各个年龄段的基因突变情况，展示了40岁及以下的患者驱动癌基因突变情况
图4. LUAD亚型中驱动癌基因突变情况
最后小结一下，作者首先分析了996例日本肺腺癌LUAD临床和病理特征随后对对125例驱动癌基因阴性的日本LUAD进行了进行全外显子测序和/或RNA测序，在88例（70.4%）患者中发现了与TCGA不同的特定热点突变，同时鉴定出FGFR2和NRG2α的两个新融合。随后作者基于mRNA表达谱聚类可以预测患者的预后，并构建了由三个基因组成的预后模型。最后作者统计了驱动癌基因在LUAD各组织类型的数量，每个驱动癌基因分布在所有组织学亚型中。作者还做了年龄与驱动癌基因突变的分析。