4+分干湿结合模板：简单分析简单实验
Identification of potential novel differentially-expressed genes and their role in invasion and migration in renal cell carcinoma潜在新型差异基因的鉴定及其在肾细胞癌的侵袭和迁移中的作用
一、研究背景
透明肾细胞癌（ccRCC)，肾癌中最常见的亚型，是一种致命的泌尿系统肿瘤，它的发生和进展的机制仍不完全清楚。鉴于RCC与高发病率和高死亡率有关，必须更好地了解该病的病因学并识别新的疾病相关的诊断、预后和治疗的标志物。
ccRCC中的一些分子已被筛选为潜在的新的预后标志物，但它们很少被系统地验证，用于早期检测和预测的ccRCC标志物在很大程度上仍是未知的。通过对肿瘤样本中差异表达基因（DEGs）和DEGs参与信号通路之间的关系进行系统和综合分析，可能对ccRCC的进展和治疗敏感性有新的认识。RNA-seq能够在鉴定基因中发挥重要作用，更进一步的转录组学分析是了解清楚ccRCC的关键。
在本研究中，作者对三个原始微阵列数据集进行了分析，筛选出20个枢纽基因进行富集分析和生存分析，并最终鉴定了金属蛋白酶1组织抑制因子(TIMP1)作为一种可能与ccRCC患者预后相关的基因。
二、分析流程
三、结果解读
1、肾细胞癌中DEGs的鉴定、以及DEGs的GO和KEGG富集分析
图1 A-D 来自三个数据集的两组样本中的DEGs以及Venn图
作者从GEO中选用3个数据集，分别将每个数据集中的数据分为两组（ccRCC组和癌旁正常肾组织组），使用R包limma在两组之间筛选DEGs。从GSE66272、GSE100666和GSE105261中共提取4224、3879和549个DEGs（图1A-C）。
使用Venn软件，识别三个数据集的共有DEGs（DEGs的挑选指标：log2|FC|>1且p<0.05）。共发现310个重叠的DEGs，其中133个上调（log2FC>1)，177个下调（log2FC<1)。
表1 DEGs的GO和KEGG富集分析
作者使用DAVID对310个DEGs进行了GO和KEGG功能富集。结果显示（表1）：
GO：DEGs主要参与这些生物学过程：细胞外基质的组建和分泌、药物反应、血管生成和缺氧反应。DEGs主要集中在外泌体、胞外区、根尖质膜、胞外间隙和基底外侧质膜。分子功能的变化主要体现在蛋白质同源二聚体活性、ATP酶结合、相同蛋白质结合、细胞外基质结合和细胞外基质结构组成等方面。
KEGG：DEGs在碳代谢、抗生素的生物合成、醛固酮调控的钠重吸收、集合管酸分泌和吞噬小体途径等方面显著富集。
2、DEGs的PPI的模块化分析
图1E&F DEGs的PPI网络和PPI网络中最重要模块
表2 最重要模块的GO和KEGG通路富集分析
作者通过STRING数据库和Cytoscape软件对310个DEGs构建PPI网络（图1E）。随后通过Cytoscape插件（MCODE）发现PPI网络中最显著互连的基因模块，该模块共有21个节点和74个Edge数（图1F）。
作者对最显著互连的模块进行GO、KEGG功能富集，结果显示（表2）：
GO：该模块基因主要参与的生物学过程有胶原分解、细胞外基质的构建、对氨基酸刺激的细胞学应答以及血小板脱颗粒过程。该模块基因最主要集中在细胞外区域，其次是内质网管腔、细胞外基质、胶原三聚体以及胶原四聚体。该模块基因在分子层面的功能主要体现在：细胞外基质结构性成分、血小板衍生生长因子的结合以及蛋白质结合。
KEGG：该模块基因参与的通路主要是：受体相互作用、蛋白质的消化和吸收、PI3K-AKT通路、黏着斑和阿米巴病。
3、基于TCGA的关键枢纽基因的选择和生存分析
图2 中心基因的互作网络和分析
上文，作者已经构建了PPI网络。接下来，作者根据连接数>10的标准过滤出30个枢纽基因，Cytoscape软件的插件 cytoHubba识别和可视化了连接度最丰富的20个枢纽基因（图2A）。
作者使用cBioPortal在线平台识别枢纽基因的共表达基因，并得到枢纽基因和共表达基因的互作网络（图2B），节点黑边加粗的为枢纽基因，其他节点为共表达基因。随后通过 ClueGO 和 CluePedia对枢纽基因的进行功能注释分析和KEGG途径分析，提示枢纽基因可能与细胞间连接和细胞间信号转导有关（图2C&D）。作者在TCGA数据库ccRCC和正常肾组织两组之间，对枢纽基因进行了层次聚类分析，得到热图（图2E），可看出枢纽基因在ccRCC组和正常组之间存在表达水平的差异。
图3 K-M曲线展示中心基因的单变量生存分析
为了确定上文的枢纽基因是否具有临床相关性，作者在TCGA肾癌数据集中，探究枢纽基因与RCC预后的相关性，从而获得与患者预后显著相关的基因。为了筛选与预后相关的基因，作者在GEPIA数据库中发现OS和DFS显著降低的患者有高表达的TIMP1，且结果显示ccRCC组和正常组患者OS和DFS之间的显著差异具有统计学意义（图3A&B)。这提示TIMP1对于ccRCC的进展起了关键作用。
此外，作者在TCGA数据库中的533例ccRCC样本和72例正常样本中发现，TIMP1表达水平在ccRCC组织中显著上调（p<0.001,图3C）。
4、分析最重要的枢纽基因TIMP1
图4 在ccRCC患者中，TIMP1的转录表达与晚期临床病理参数和较差的生存结果显著相关
作者进一步使用了Oncomine中4个数据集验证，结果均与TCGA数据库的结果一致，即TIMP1在癌组织中显著上调（图4A）。
作者在TCGA数据库中分析了正常组织和不同分期分级癌组织的TIMP1表达水平。TIMP1在ccRCC组织中的表达与肿瘤分期显著相关，在高分期肿瘤（3分期和4分期）中TIMP1表达量最高（图4B)。TIMP1在ccRCC组织中的表达还与肿瘤分级显著相关，肿瘤分级升高，TIMP1表达升高（图4C）。这表明，TIMP1的表达与晚期临床特征有关。
图5 GSEA获得ccRCC中显著相关的基因和特征通路
作者使用GSEA分析了TIMP1生物学特征。结果表明，TIMP1参与的生物学过程主要为上皮间质转化（EMT)、炎症反应以及IL6/JAK/STAT3通路（图5A-C）。此外，作者还展示了100个重要基因转录表达谱的热图（图5D）。
5、TIMP1的表达与细胞间质表型有关
图6 TIMP1表达与EMT
由于GSEA提示TIMP1参与EMT，为深入了解ccRCC中TIMP1与EMT表型的关联，作者对TIMP1以及EMT的标志物（E-cadherin & N-cadherin。E-cadherin是上皮细胞的标志物，N-cadherin是间质细胞的标志物）进行了qRT-PCR及Western Blot。使用两个ccRCC细胞系（A498 & Caki-1)和一个正常肾细胞系HK2。与正常细胞系HK2相比，在ccRCC细胞系中TIMP1表达上调，N-cadherin上调，而E-cadherin下调（图6A-D）。这提示TIMP1表达水平与EMT表型有关。
为进一步验证TIMP1与EMT的相关性，作者展示了TIMP1与细胞间质相关基因的关系。使用GSEA分子signature数据库检索了200个间质相关基因。接着，作者通过相关性检测（Pearson和Spearman相关）计算了TIMP1表达水平与间质基因的相关性（TIMP1表达情况选自三个GSE数据集）（补充表展示了相关结果）。总体而言，所有细胞间质相关基因均与TIMP1有显著相关性。
6、敲除TIMP1后在ccRCC细胞系中观察到MET
图7 TIMP1的敲除介导了A498和Caki-1的MET
将有TIMP1 shRNA或者NC的慢病毒转染至A498和Caki-1（两个ccRCC细胞系）。慢病毒转染后，在A498和Caki-1细胞系中观察到TIMP1 mRNA水平的显著下降，且Western blot分析证实，TIMP1蛋白在A498和Caki-1细胞中均受到抑制。这表明已经实现TIMP1敲除。（图7 A-C)
在A498和Caki-1中敲除TIMP1后，通过Western blot和qRT-PCR，可以看出E-caderin（上皮细胞标志物）上调，N-cadherin（间质细胞标志物）下调（图7C-G）。这表明TIMP1的敲除介导了A498和Caki-1的MET表型。
7、敲除TIMP1可以抑制A498和Caki-1的细胞迁移和侵袭
图8 TIMP1基因敲除抑制A498和Caki-1细胞的迁移和侵袭
由于细胞迁移和侵袭特征被认为是EMT的重要后果，作者随后研究敲除TIMP1后是否会影响细胞迁移和侵袭，从而探究TIMP1是否为介导EMT表型的必要因素。作者进行transwell迁移和入侵试验，发现敲除组的迁移和侵袭率与对照组相比有所下降（图8A-D）。本实验进一步证明了TIMP1介导EMT导致细胞出现迁移和侵袭特征。
小结
与正常样本相比，来自GEO数据库的原始ccRCC样本存在DEGs，作者对DEGs进行了GO和KEGG富集分析，并构建PPI网络并对最显著互连的基因模块进行了基因功能注释。作者通过PPI网络筛选出枢纽基因，并发现与ccRCC预后相关的关键枢纽基因TIMP1。作者探究TIMP1在癌组织中的表达水平及TIMP1与ccRCC晚期临床特征的相关性，并通过GSEA发现它与EMT、炎症反应、IL-6/JAK/STAT3通路显著相关。作者验证TIMP1可介导EMT，且敲除TIMP1后可抑制EMT表型。因此，TIMP1可通过EMT促进ccRCC进展，它可以作为ccRCC的一种预后标志物。
研究表明，EMT可以促进癌细胞产生促炎因子，炎症也可以反过来促进肿瘤中的EMT。IL-6/JAK/STAT3信号通过抑制抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤细胞的生长和转移。因此，靶向TIMP1的促炎途径、抑制IL-6通路可能为治疗ccRCC提供策略。
局限性：TIMP1介导EMT的分子机制有待进一步阐明。除此之外，枢纽基因参与ccRCC的进展的详细机制仍有待进一步阐明。