访湖南省肿瘤医院蒲兴祥博士：临床医生眼中肺癌高通量基因注意事项和发展趋势

近日，小编有幸邀请到了湖南省肿瘤医院蒲兴祥教授，为我们带来肺癌高通量领域的相关知识。

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问：肿瘤是我们一直没有攻克的生命难题，您对肿瘤治疗有什么看法？未来应该朝哪个方向去努力？

答：虽然近年来肿瘤的治疗手段不断创新，5年生存率一直在提高，但是还有很大提升空间。当前对于肿瘤的认识在不断加深，如靶向治疗，产生耐药，更换靶向药，再产生耐药，如此多次循环为患者争取到了越来越长的高质量的生存期，这是肿瘤治疗史上的巨大进步。

肿瘤学处于精准医学研究的最前沿。此前的肿瘤治疗模式大多基于粗略的肿瘤分类，采用统一、流程化的治疗方案。如今，这种治疗方式正逐步演变为利用患者个人癌症基因组信息分析结果的个性化治疗。除此之外，另一种新型疗法便是免疫疗法，为医生、患者、研究人员都带来了极大的振奋。免疫疗法的策略包括嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法、免疫检查点抑制剂以及癌症疫苗。以上治疗方法都已被证实具有临床效应，并拥有巨大的应用前景，但精准医学和肿瘤免疫治疗仍面临着一些挑战。

问：您认为精准医学在临床中最大挑战是什么？

答：动态变化，肿瘤的本质是自我进化，无论是同一肿瘤还是不同肿瘤间都存在着大量的时间、空间上的异质性，这种异质性会导致表型变异，对治疗有着不同的应答，遵循着“适者生存”筛选法则。靶向治疗是基于每位患者的基因组特点和其体内特定癌症相关变异进行相应治疗，但是这种治疗策略由于缺乏针对特定基因变异的生化试剂而受到限制。在临床实践中，人们通常能够检测到癌症患者体内有意义的基因突变，但往往缺少针对这些突变的治疗药物。此外，还存在另外一种情况，那就是使用的靶向药物不具有抗癌作用，这种情况可能是肿瘤异质性和药物对于靶基因治疗的变异导致，也可能是不同患者间生理生化差异造成分子通路不一致导致。

问：您从事肿瘤基础和临床研究工作，您认为在肿瘤研究从基础到临床应用的转化过程中有哪些主要难点？

答：肿瘤研究无论是基础还是临床一直以来都是医学研究领域的热点，正因为有了这些大量研究为基础，才促使了人们对肿瘤有了更全面的认知，也使得人们更好的认识到哪些基础研究可以实现向临床的转化，从而推动着肿瘤临床学的迅猛发展。但基础到临床的转化还有很长的路要走，绝大多数的基础研究，到临床的转化应用都是有难度的，要最终能够进入临床应用，这需要其他一些因素来推动。比如发现一个新的靶点，针对该靶点有了新的药物，这个药物需要通过临床研究来验证，包括临床前研究、早期的临床研究、三期的临床研究，再到上市，这个过程快则三到五年，慢则可能需要十年时间。

问：您对非小细胞肺癌分子靶向药物治疗耐药机制的研究比较深入，请您介绍一下NGS在这方面的临床指导作用和科研上的应用情况。国内外在NGS上的应用有哪些不同？ 

答：NGS已经广泛应用于临床和科研中。针对肺癌，NGS在临床中使用主要体现在多基因监测指导个体化靶向药物选择；动态监测肿瘤发展，预测复发转移和耐药评估；发现耐药机制，指导治疗措施的调整。这些方面当然也是临床医生的转化研究的方向，特别是未知的潜在的可靶向的突变/融合基因的研究，可以促进对肿瘤的发生、发展和耐药机制的认识。这也研究进一步促进的临床诊断和治疗水平的提高。

在应用中发现，不同的平台产生的结果仍存在一定差异，甚至一个平台产生的结果也不尽相同。很多检测DNA的产品，检测范围以基因数来算是非常大的，动辄几百个基因。虽然几乎所有肿瘤驱动基因都有靶向药处于不同研发阶段，但成药的不多，看FDA、NCCN等一些机构推荐的靶点屈指可数，所以测了这么多的基因，对科研可能非常有用，然而具体到患者直接用途是有限的，而且基于DNA的NGS融合检测能力非常有限，无法找到正确的融合伙伴。这是以临床为出发点和以技术为出发点比较明显的一个区别。

分析美国的分子和生物领域结构分布，我们发现研究所和医院建立的大型检测机构占整个国家基因检测市场的60%，第三方检测占30%。而我国则完全不同，国内病理行业的人员对疾病的发生、发展，对医学方面的理解素质很高，但是欠缺了实验室的管理、流程、规范化建设以及对生物和信息学的理解等方面的知识。而在公司里，则有来自不同知识背景的优秀人才，包括生物、计算机、数据分析等，而且实验室规范有强大的活力。医院与第三方机构的优势互补。医院要学习公司的多方面知识，公司也要向临床学习落地实践经验，临床经验对推动精准医学的发展很关键。双方合作学习，互相交流借鉴，共同提高，实现优势互补，也有利于整个行业的发展进步。

问：您怎么看NGS和传统检测技术的关系？当前高通量检测还存在哪些问题？能给我们分析一下吗？

答：纵观技术的发展，FISH、免疫组化、RT-PCR等技术与NGS技术相比算是传统技术。但每种技术都有自身的特点，包括适用范围、技术内涵、适用人群和方法以及临床应用等。NGS与传统的RT-PCR、免疫组化和FISH等技术应该是相互补充、相互弥补的关系。NGS有兼容多种类型样本的能力，有单次检测同时分析多种变异的能力，这使得其具备非常强大的“事前探索”能力，传统的成熟技术有着非常规范、标准的应用，适合“事后确认”。

目前国内高通量检测技术参差不齐、每家高通量检测对于大panel、TMB的定义、检测敏感性和特异性、价格问题都存在很大的差异。缺少规范，这是国内高通量检测中存在的非常重要的问题。比如现在所有的检测，包括液体活检标本基于ctDNA的检测，组织标本基于DNA的检测，其对于基因突变的检测敏感性已经和第一代测序相差无几。但是对于一些融合基因、扩增基因的检测敏感性仍然存在问题。我们知道，像ALK、ROS1、RET 、NTRK这些融合基因在临床当中占据了很重要的位置，在中国人群中，融合基因在腺癌中的发生率在10%~20%之间。目前逐渐出现了基于DNA和RNA的双检测为主的检测技术，这有助于提高一部分融合基因的检出率。

问：您提到基因融合，也有专家表示，基因融合现象在肿瘤病因及诊疗中非常重要，却是当前很多基因检测的痛点。您如何看待这一问题？基因融合检测目前的难点是什么？

答：因为一些突变比如说EGFR等常见的靶点在肺癌当中有很高的比例，中国人群中40-50%，所以传统上对碱基突变关注比较多，对基因融合关注较少。但从肿瘤精准治疗史的时间维度来看，第一个靶点是血液肿瘤中的BCR-ABL融合靶点。在肺癌当中，除了第一个靶点EGFR是突变以外，第二个靶点ALK和第三个靶点ROS1都是基因融合。另外近期多个备受关注的靶点比如是NTRK，FGFR，MET等都是融合变异。变异的人群分布比例是不均匀的，突变确实要高于融合，但目前极具潜力的药物作用靶点明显偏向基因融合，如ALK融合---堪称“钻石靶点”5年生存率从之前不足10%提高到50%以上，可以看出融合基因的检测对患者的有效治疗是非常重要的。

融合基因为什么难以检测呢？有多个方面的原因。首先，融合是两个基因之间的事件， 除了一个发生融合的靶基因外，还存在一个伙伴。该伙伴是基因组范围的，甚至是基因间的序列，或靶基因本身，事先往往不知道它会是什么。此外，靶基因和融合伙伴的拼接点分布在一个区域之内，也是未知的。两个“未知”叠加起来，融合基因检测难度可想而知。其次，以DNA为模板检测融合的方式并不是一个好的解决方案，因为内含子区域非常冗长，且有些高GC和重复区域无法富集无法覆盖，容易漏检。第三，从融合机制上看，可分为DNA层面上的结构变异和RNA层面上的剪切变异，若仅以DNA为模板，势必遗漏RNA剪切过程中发生的融合。