【大家之言】Charles CC Lee：qPCR和荧光光谱：有毒蓝藻实时定量监测技术的应用分析
小编导读
有效的水质在线预警技术对于水库的安全运行有重要意义，对于水库可能出现的水质风险，提前的预警将为相应的应对措施带来重要的应对时间。上海地处亚热带且处于长江流域下游，春夏之交易出现藻类问题，是上海供水安全的巨大威胁。经本刊约稿，新加坡纽卡斯尔大学Charles CC Lee教授将传统荧光光谱分析法和qPCR技术进行了对比和详解，各呈优势，为水库水华爆发时有毒蓝藻的实时定量监测提供了新的思路。
Charles CC Lee
加拿大圭尔夫大学获得学士学位，美国夏威夷大学获得硕士和博士学位。从事环境领域的工作超过25年。
曾在美国顶尖的环境咨询公司Woodward-Clyde Consultants从事咨询工作，后在新加坡科技研究局（A*STAR）从事研发工作，目前在澳大利亚纽卡索大学从事教学管理和科研工作。
研究领域包括环境可持续发展、环境废弃物管理、环境健康、工业废弃物生物处理等。
藻类爆发可由营养物、温度、光照、水文条件等环境因素以及电导率、盐度、浊度等化学指标的变化引起。由于全球气候的变化，藻类爆发事件的数量在北美（五大湖地区）及亚洲众多地区（中国、东南亚等）正以惊人的速度增涨。蓝藻是藻类爆发的主导物种，会产生藻毒素等致命产物，对人类和水生生态系统造成危害；其中微囊藻毒素不仅会损伤人体的肝脏和神经系统，同时也是一种潜在的致癌物质。目前，关于海洋、咸水及淡水中有毒蓝藻的鉴定和监测的文献研究并不鲜见，然而对于稳定可靠的24/7藻类实时监测系统的需求却迫在眉睫。实时监测系统须能在藻类爆发前后实现有毒蓝藻的快速检测和有效鉴定，以防止鱼虾大规模死亡，确保供水安全。
自20世纪60年代初期开始，荧光检测技术逐渐开始受到关注。当光被叶绿素分子吸收时，其中一部分吸收的能量会以荧光的形式重新辐射出来，而荧光检测技术能通过识别荧光辐射产生的特征激发光谱来分析光合细菌（如蓝藻）中的叶绿素分子，其具有省时省力的优点，并能收集大量的监测数据。
与此同时，近十年来，定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技术逐渐得到应用，即通过采用实时聚合酶链反应的分子探针来鉴别水环境系统中特定的蓝藻种类。这一快速便捷的实验室技术目前正在迅速发展，以实现实时的24/7藻类监测。
本文主要对比了传统的光谱分析法和迅速发展的分子学方法——qPCR技术在蓝藻监测方面的应用。首先简要介绍了两种方法的背景，随后对两者的优势进行比较。
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传统荧光光谱分析法
叶绿素-a是一种光合色素，存在于包括真核生物（藻类）和原核生物（蓝藻）在内的所有浮游植物中，是用于计量浮游植物总生物质的有效且广泛使用的指标。然而蓝藻的色素系统产生的叶绿素-a荧光信号非常微弱。与此同时，蓝藻的荧光发生系统主要位于光系统II，而光系统II主要由藻青蛋白（PC）和藻红蛋白（PE）等藻胆色素构成。因此可通过分析藻胆色素荧光光谱携带的大量信息，测算蓝藻的丰度，这就需要对藻胆色素的荧光光谱进行优化。
图1显示了四种不同的藻类和黄色物质（YS，yellow substances）的标准光谱。对于蓝藻色素来说，PC所在的蓝藻组和PE所在的红藻组分别在610和570 nm的波长下检测到了强烈的荧光信号，因此可通过最优激发波长的改变，实现某一特定藻类荧光标记的优化。基于此，在680 nm的发射波长下，采用发光二极管，microLAN系统可分别在570、615和450 nm的选定激发波长下检测PE、PC和叶绿素-a产生的荧光强度。此外，对于水样中一些会干扰检测的其他荧光物质，如溶解性有机物（365 nm）、浊度（710 nm）等，系统也会进行相应的修正。
图1 四种不同藻类和黄色物质的标准光谱图
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分子探针——qPCR技术
自人类基因组计划（1990~2003）开始以来，快速分子生物学工具的开发应用得到了大量关注，它们可用来鉴定存在于敏感生态系统中且对人类具有毒性的特定微生物种类。首次采用实时PCR技术来监测有毒的浮游植物是在2000年。蓝藻专有的基因标记可以以负责生成微囊藻毒素、节球藻毒素、蛤蚌毒素以及拟柱孢藻毒素等毒素的产毒基因为目标。
Koskeenniemi等的研究采用特定的PCR引物（SYBR green），同时以结球藻毒素基因亚基（nDaF）为目标，结果表明，波罗的海水样中的基因拷贝数（即蓝藻数量）和结球藻毒素的浓度存在强烈的相关性。该qPCR技术可用于具体研究波罗的海中结球藻的爆发和结球藻毒素的形成。
一篇研究报告在综述33项研究（2003年~2015年）的基础上，通过分析微囊藻毒素浓度和qPCR数据之间的相关性，对于qPCR技术能否可靠指示淡水中的蓝藻毒素风险进行了评述。根据相关性分析的结果，其中的22项研究显示为正相关（65%），11项为无相关性（33%）。然而，对于上述相同的研究组来说，当检验微囊藻毒素浓度和叶绿素-a或蓝藻细胞数量之间的相关性时，85%的情况显示为正相关。因此，通过与传统方法的比较，研究者对于采用qPCR技术来评估有毒蓝藻爆发风险的可靠性提出了质疑。
尽管采用qPCR技术来评估蓝藻爆发毒性，其结果有时存在争议，但qPCR技术在蓝藻菌群的动力学研究中仍具有重要价值，比如研究有毒菌株相对丰度的时间和空间变化、分析蓝藻爆发的动力学情况及其与环境因素之间的关系等。qPCR技术的另一大优势是它能同时检测多个目标基因，称为“多重qPCR”（multiplex qPCR），比如可同时将微囊藻毒素、节球藻毒素、拟柱孢藻毒素以及蛤蚌毒素四种有毒的生物合成基因簇作为目标。对51种毒性和非毒性蓝藻菌株的检测已证实了多重qPCR技术的特异性。采用该方法，成功检测了澳大利亚墨累河中混合蓝藻水华的毒性。
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方法比较
采用两种技术手段，对现场条件下的蓝藻进行24/7实时监测，并对两种方法进行了比较。需要指出的是，尽管实时qPCR技术已有实验室现场原型（field prototype），但目前还没有可商用的qPCR系统来实现对蓝藻的24/7现场实时监测。然而，qPCR技术目前正在迅速发展，且其在蓝藻爆发的前期监测中具有关键作用，因此有必要对两种方法进行比较。
表1总结了两种方法的关键差别。传统光谱方法通过识别不同光合色素（叶绿素-a、藻青蛋白、藻红蛋白等）特有的激发-发射光谱特征来鉴定不同的藻类，而qPCR技术则通过先进的分子学手段鉴别出不同种类的蓝藻。由于qPCR技术在样品的运送和准备过程中都需要专业生物测定手段的支持，因此参与qPCR实时监测的技术人员所需具备的专业门槛要高于采用传统方法的技术人员。如果是在发展中国家或偏远地区应用qPCR技术，这类在分子生物学领域具备专业能力的技术人员将更难招募。
基于传统光谱法的24/7实时监测系统通常是以探针或固定化系统的形式在现场部署，市面上容易购得相关设备，其成本一般由监测范围的大小而定，通常可负担得起。因此相对而言，基于qPCR技术的24/7实时监测系统成本可能要高得多。
在未来3~5年内，我们有望看到传统方法向商用24/7实时流式细胞监测法（flow cytometry monitoring）的发展进化；而对于qPCR技术来说，基于“芯片实验室”（lab-on-a-chip）技术的现场原型将使得实时监测系统的商业化应用更具可行性。
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结论
采用荧光光谱技术鉴定蓝藻是一项突破性的应用，是实现快速、可靠、24/7实时的水系统蓝藻爆发监测的有力手段。目前传统的光谱学方法已广为人知，且在24/7藻类实时监测系统中广泛应用，与此同时采用分子学技术的qPCR方法在过去十年间也得到了迅速发展。qPCR方法能够单独鉴定一种或同时鉴定多种（4~5种）有毒蓝藻菌种，具有显著优势。在全球气候环境越来越多变的状况下，传统的光谱技术和先进的qPCR技术将继续共同发挥关键作用，为研究人员、监管人员和决策人员在藻类爆发的管理和防治方面提供重要信息和依据。
英文原文可详见《净水技术》2018年第3期“大家之言”栏目。
编辑札记
对藻类的在线预警一直是原水水质管理人员关注的焦点，与传统水厂工艺相比，预警技术仍处于发展期和摸索期，百家初放，各显神通。将qPCR法和荧光光谱法作对比分析，客观论述了两种技术的术有专攻与应用限制，本无优劣之分，但对于不同需求的水库管理，各有用武之地，能帮助我们更好地理解藻类的在线预警技术的进展，为水库管理者提供思路。
推荐参考
qPCR和荧光光谱：有毒蓝藻实时定量监测技术的应用分析[J]. 净水技术, 2018,37(3): 4-9.
qPCR and Fluorescence Spectrum: Real-time Monitoring of Toxic Cyanobacteria in Algal Blooms[J]. Water Purification Technology, 2018, 37(3): 4-9.
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