【干货分享】大肠菌群平板计数法的常见问题及解答分享!
食品微生物检测
大肠菌群是食品污染程度的重要参数指标，是反应食品质量的必测项目，因此，很好地掌握其检测方法以及在检测全过程中的常见问题及解决办法是每一个食品检测人都应该具备的技能。
在大肠菌群平板法检测过程中，你是不是经常有这样或者那样的疑问呢？比如这个菌落是典型的吗？如何确认验证？......
小编今天分享这篇文章，针对我们检测过程常见的问题，全都给出了答案，接下来我们一起look,look!
一、VRBA培养相关问题
1.所用器皿是否需要灭菌？
答：不需要。配制培养基所用到的锥形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要灭菌，但要求一定要清洗干净，表面无污渍、无残留。煮沸完成后，取下锥形瓶，用一般常用的卫生纸（软纸）覆盖瓶口，用橡皮筋缠绕，待冷却至适宜温度即可倾注培养基。在倾注培养基时，须点燃酒精灯，稍微灼烧锥形瓶口。
2.如何保持“煮沸2min”？
答：可以用电磁炉或电热板进行加热煮沸，在该培养基即将煮沸时调低温度。实际操作时，不需要严格按照此要求进行，加热煮沸数秒即可。原因：本培养基很难保持煮沸2min，一旦煮沸，则培养基很快上涌、翻腾，若不调低温度或立刻采取其他措施，则培养基可在数秒内喷涌出来，严重者可喷涌2米以上、电磁炉周围1—2米范围内都是培养基飞溅的范围（实验室危险因子之一）。
3.若培养基未用完，是否可以冷藏起来下次用？
答：不可以。4789.28中已规定，固体培养基最多允许熔融1次（指的是经过高压灭菌冷却后的培养基还可以熔融一次后使用）。且VRBA培养基冷却后，再次熔融时非常容易喷涌，若温度控制不当，底部培养基熔融后很快就会发生喷涌（即培养基未完全熔融就会发生喷涌现象）。
4.倾注完成后是否需要“覆盖一层”？如何覆盖？
答：一般情况下不需要覆盖。在实际操作过程中，若检验员初次接触该食品（或食品品类），则有必要在倾注培养基后再覆盖一层（原因是不清楚该样品是否会发生蔓延）。而如此往复测试几次后，若该样品或食品品类均不存在蔓延现象，则以后的实验中都不需要进行覆盖。若重复多次测试后都有蔓延现象，则以后的检验中最好都进行覆盖，最好是在原培养基已凝固或半凝固（不会发生晃动）时再倾注一层培养基（“一层”是指缓慢倾注培养基至培养基刚好能够覆盖整个平皿）。
二、如何确定培养基上长的是不是大肠菌群？
答：不要去管什么是大肠菌群的典型形态，建议新手们认真按照标准进行证实试验，此证实试验非常简单，每一次VRBA上有菌落生长都进行证实试验，如此往复3-4次，对于哪种形态才是大肠菌群已经能够了然于心了。建议平时多配一些BGLB肉汤管冷藏储存备用，需要进行证实试验时分分钟可以完成试验（BGLB肉汤管一般可储存2-3个月，建议配制10-20管左右，不要配制太多，证实试验很少做）。
三、两个梯度都长了菌，如何选取？
答：选取15-150CFU之间的平板（指的是VRBA平板上所有菌落数在此范围），挑取可疑菌落进行证实试验。详细举例说明：若有两个连续梯度的4个平板上菌落数均在15-150之间，则4个平板上的菌落都要挑取进行证实试验，实际操作时，可灵活操作，如：1:10的两个平板上的菌落数分别为120、123，1:100的两个平板的菌落数分别为16、18，严格来讲必须至少在每个平板上分别挑取5个可疑菌落、5个典型菌落进行证实试验，如此需要40根BGLB肉汤管。建议使用镍合金接种环（即传统的接种环，而不是一次性塑料接种环），因为VRBA上生长的菌落（无论典型或可疑）大部分长在底层、且菌落一般较大，被培养基覆盖，传统的接种环较细，用以刮去上层培养基较方便，挑取菌落也较方便。
四、如何进行证实试验？菌落选取数量？
答：同上所述，建议新手们VRBA上的所有不同形态的菌落都进行证实试验。每种不同形态都挑取5个进行证实试验（若BGLB管足够，建议多挑取几个进行试验）。
注意：A.每种可疑菌落挑取5个，每个菌落放入1管GBLB管中；B.“产气者，记为大肠菌群阳性管”，就要求在实验前须认真筛选BGLB管，凡产气的GBLB管应弃去不用。
五、结果如何计算？
答：首先，在VRBA培养24h后进行计数，分别计数可疑大肠菌群和典型大肠菌群（何为可疑、何为典型？同“2”，检验员多进行几次实验后自然很清楚典型的大肠菌群是何种形态）的数量。假如在1:10的平板上可疑大肠菌群有10个，典型大肠菌群有6个；证实实验应该按照可疑跟典型5:3的比例进行挑选。
例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100*6/10*104/g（mL）=6.0*105CFU/g（mL）。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
六、若平板上很多菌落，最终证实全部为阴性，结果如何计算？
答：首先是证明提问者没有认真看标准。“很多”是多少？是否在15—150范围内？是哪一个稀释度？根据第3条,选取适宜菌落数的平板挑取菌落进行证实试验，若证实全部为阴性，则需要再挑取更低稀释度的平板上的菌落（建议可疑和典型菌落分别挑取10个）进行证实试验，若第二次证实试验均呈阴性，以＜1乘以最低稀释度进行计算，如：1:10的平板菌落数分别为120、123，1:100的平板上菌落数分别为16、18，首先挑取1:100的两个平板上的菌落进行证实试验，若全部为阴性，再挑取1:10的两个平板上的菌落进行证实试验，若1:10的平板上的菌落数证实为阴性，则最终计算过程为＜1x10，最终结果为＜10；若1:10的的平板上的菌落有阳性管，则按照第5条进行计算。
来源：食品论坛网友分享
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