吕建林：线粒体功能障碍是肾结石病发病的重要因素
Front Physiol. 2020; 11: 566506.
Published online 2020 Oct 20. doi: 10.3389/fphys.2020.566506
PMCID: PMC7606861
PMID: 33192563
Mitochondrial Dysfunction and Kidney Stone Disease
Sakdithep Chaiyarit and Visith Thongboonkerd*
Abstract
线粒体是一种关键的细胞内细胞器，在调节能量产生、氧化应激、钙稳态和细胞凋亡中起着至关重要的作用。肾结石病（肾结石/尿石症），特别是草酸钙（CaOx；最常见的类型）已被证明与氧化应激和组织炎症/损伤有关。最近的证据表明，线粒体功能障碍与 CaOx 晶体保留和聚集以及 Randall 斑块形成有关，所有这些都是肾结石形成的基本机制。本综述强调了线粒体在肾细胞功能中的重要作用，并提供了从先前对与肾结石疾病相关的线粒体进行的研究中获得的数据。此外，还总结了线粒体功能障碍参与肾结石病理生理的机制。最后，讨论了通过线粒体保存防止肾结石形成的新方法的未来前景。
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Introduction
线粒体是一种独特且动态的细胞内细胞器，其形状、大小和数量因各种细胞类型而异。它是唯一具有双层膜并包含自己基因组的亚细胞器。与核 DNA 不同，线粒体 DNA (mtDNA) 是不受组蛋白保护的环状双链 DNA（Sharma 和 Sampath，2019 年；Yan 等人，2019 年）。通常，线粒体通过氧化磷酸化途径将氧气和营养元素转化为三磷酸腺苷 (ATP)，是人体细胞中最重要的细胞能量发生器。三羧酸 (TCA) 循环（克雷布循环或柠檬酸循环）和电子传递链 (ETC) 是在这种能量产生机制中起关键作用的两个主要代谢过程 .此外，线粒体还涉及所有细胞和组织中细胞氧化应激、钙稳态、细胞凋亡信号通路和衰老过程的调节。因此，线粒体功能障碍会导致各种代谢疾病和其他疾病的发展，例如糖尿病、肥胖症、衰老、癌症、肌病和神经退行性疾病。有趣的是，肾结石疾病（肾结石或尿石症）已被证明与线粒体功能障碍直接或间接相关。
这篇综述强调了线粒体在肾细胞功能中的重要作用，并强调了线粒体功能障碍与肾结石病病理生理学之间的关联，以及通过保护线粒体功能来预防肾结石形成的新方法的潜力。
电子传递链(electron transport chain,ETC)是一系列电子载体按对电子亲和力逐渐升高的顺序组成的电子传递系统。所有组成成分都嵌合于线粒体内膜或叶绿体类囊体膜或其他生物膜中,而且按顺序分段组成分离的复合物，在复合物内各载体成分的物理排列也符合电子流动的方向。其中线粒体中的电子传递链是伴随着营养物质的氧化放能，又称作呼吸链
线粒体在肾细胞功能中的作用
肾脏是继心脏之后,细胞中线粒体数量最多的器官。泌尿系统需要足够的能量来维持稳态、血液过滤、营养重吸收、体液和电解质调节、酸碱平衡和血压调节。细胞能量的最重要来源是由线粒体产生的，线粒体是支持肾细胞功能的关键细胞内细胞器。特别是，近端肾小管细胞是富含线粒体的细胞，其线粒体密度高于沿肾单位排列的其他细胞，因为它们的功能需要更多的能量，包括但不限于水、葡萄糖、离子和营养素。此外，集合管的插入细胞是其他富含线粒体的细胞，在酸碱平衡和钠、氯和钾转运的调节中发挥作用。
生产能量的ATP 分子主要通过氧化磷酸化过程中通过 ETC 跨线粒体内膜 (MIM) 的电子转移产生。此外，三羧酸循环在线粒体能量产生中也起着关键作用（福布斯，2016 年）。TCA 循环在线粒体基质中产生以下辅酶，包括三分子尼古丁腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 和一分子黄素腺嘌呤二核苷酸 (FADH2)，以乙酸或乙酰辅酶 A（乙酰辅酶A）的形式转化为一分子葡萄糖糖酵解后通过丙酮酸脱氢酶生成丙酮酸（Pieczenik 和 Neustadt，2007 年；Ralto 等人，2020 年）。除了糖酵解，脂肪酸氧化是另一种机制，它可以产生更多的乙酰 CoA 分子以进入 TCA 循环。因此，与糖酵解相比，脂肪酸氧化会产生更多的 NADH 和 FADH2 分子（Sharpe 和 McKenzie，2018 年）。来自 NADH 和 FADH2 的电子分别转移到 MIM 中 ETC 的 NADH 脱氢酶（复合物 I）和琥珀酸脱氢酶（复合物 II）。然后电子被泛醌（辅酶 Q10；CoQ10）转移到泛醇-细胞色素 c 还原酶（复合物 III），并通过细胞色素 c 转移到细胞色素 c 氧化酶（COX；复合物 IV）（Bhargava 和 Schnellmann，2017 年）。在通过 MIM 中的 ETC 进行电子转移期间，质子被复合物 I、III 和 IV 通过线粒体膜间隙主动泵送。最后，ATP 合酶（复合物 V）利用线粒体膜间隙中的过量质子将二磷酸腺苷 (ADP) 磷酸化为 ATP（Bhargava 和 Schnellmann，2017）。肾脏对 ATP 的需求是细胞类型特异性的，因为肾小管细胞需要高能量来介导肾皮质内的主动转运功能。相比之下，肾小球段中的细胞需要较低的能量来进行过滤和其他被动过程。总的来说，肾小管细胞需要大量的线粒体及其高活性来维持多种肾功能。
氧化应激的调节
氧化应激主要是由细胞质和线粒体活性氧 (ROS) 过度释放引起的。复合物 I 和 III 的电子转移被认为是 ROS 过量产生的主要来源（Ray 等，2012）。线粒体可以消耗氧气来产生 ATP，从而产生 ROS，例如超氧化物 (O2−) 和过氧化氢 (H2O2)。这些 ROS 对于细胞信号通路和细胞周期、细胞凋亡、蛋白激酶和蛋白磷酸酶。在生理条件下，线粒体具有高效的抗氧化系统以保持与 ROS 的平衡。例如，超氧化物歧化酶迅速将 O2− 还原为 H2O2，其速度快于 O2− 的生成速度。随后，谷胱甘肽过氧化物酶通过将 H2O2 转化为水来完成还原过程。在氧化应激（病理状态）期间，由于线粒体清除系统被 ROS 产生的持续增加所淹没，即所谓的 ROS 诱导的 ROS 释放，因此会发生过量的 ROS 排放。结果，线粒体功能发生改变，导致线粒体蛋白质和酶在 TCA 循环和 ETC 中发生 mtDNA 损伤和氧化修饰。
在氧化应激条件下，核因子类红细胞 2 相关因子 2 (NRF2) 可以触发编码抗氧化酶的基因的转录因子，以应对 ROS 过量产生。这强调了线粒体抗氧化系统在维持所有细胞事件的细胞内 ATP 产生和保护线粒体功能方面的重要调节作用。特别是，谷胱甘肽氧化还原循环是在细胞质和细胞内细胞器（如细胞核、内质网和线粒体）中发现的关键抗氧化机制。线粒体谷胱甘肽 (mGSH) 是在线粒体基质中发现的谷胱甘肽的还原形式，可被超氧阴离子氧化为二硫化谷胱甘肽 (GSSG)。GSSG 可以通过需要来自戊糖磷酸途径的 NADPH 的谷胱甘肽还原酶逆转为 mGSH。这两种机制是防止氧化应激和保持线粒体功能的关键过程。
细胞凋亡的调控
已发现线粒体还涉及程序性细胞死亡或细胞凋亡（Scatena，2012）。当细胞形态/生物学因膜起泡、细胞收缩和核 DNA 片段而改变时，考虑凋亡细胞死亡（Indran 等，2011）。最终，凋亡细胞被邻近细胞和/或免疫细胞清除，以避免组织炎症和损伤。凋亡细胞死亡机制有两个主要途径，内在（通过线粒体）和外在（通过死亡受体）途径（Grancara 等人，2016 年；Abate 等人，2020 年）。然而，半胱天冬酶的激活是两种途径共同共享的共同和关键的最终过程。半胱天冬酶根据其活性分为两组，作为起始半胱天冬酶（caspase-2、-8、-9 和 -10）和效应半胱天冬酶（caspase-3、-6 和 -7）。
在内源性途径中，线粒体细胞色素c被释放到细胞质中并与凋亡蛋白酶激活因子1（APAF-1）和ATP结合，导致procaspase-9募集形成凋亡体，其中procaspase-9被裂解为caspase -9.然后caspase-9 将procaspase-3 转化为效应子caspase-3，从而完成细胞凋亡（Pradelli 等，2010）。对于外在途径，细胞外配体与死亡受体结合，导致死亡诱导信号复合物的形成，然后将 procaspase-8 裂解为 caspase-8 (Franklin, 2011)。caspase-8 可以直接刺激效应器 caspase-3，随后在细胞凋亡过程中降解多种蛋白质。此外，据报道，效应子 caspase-8 可通过增加线粒体外膜 (MOM) 的通透性来诱导线粒体释放细胞色素 c (Elmore, 2007; Indran et al., 2011)。使用内在和外在途径，线粒体因此充当调节凋亡细胞死亡的重要细胞内细胞器。
肾结石疾病中线粒体的既往研究
先前的研究表明，肾结石病的致病过程与氧化应激状态有关。在各种体外研究和动物模型（Hirose 等人，2010 年；Niimi 等人，2014 年）中发现了氧化应激与肾结石疾病的相关性。以及结石形成者（肾结石患者）。这种氧化诱导导致多个下游级联反应，特别是炎症反应和组织损伤。更重要的是，越来越多的证据表明，氧化应激引起的组织损伤增强了肾小管和/或肾间质（实质）内的致病晶体 [尤其是草酸钙 (CaOx)] 的保留，这是肾脏的关键步骤之一。结石形成，虽然许多报告表明肾小管上皮细胞中 ROS 产生过量，随后细胞损伤，但已经引入了许多抗氧化化合物来应对这种氧化应激，减少细胞/组织损伤，并抑制肾结石的形成。由于细胞氧化主要与线粒体活动有关，因此线粒体直接参与这种细胞氧化应激。
钙是最常见的阳离子，以结晶形式与其他阴离子（尤其是草酸盐和磷酸盐）一起沉淀在尿液中。这种含钙晶体常见于肾结石形成者的尿液中。在所有化学类型的肾结石中，CaOx 是世界范围内最常见的一种。结晶后，CaOx 晶体可以粘附在肾小管细胞表面，然后通过巨胞饮作用内化到细胞中，随后通过降解和/或溶解消除。这种消除过程的最终产物是游离钙和草酸根离子。当细胞内钙水平发生变化时，线粒体作为调节细胞内钙稳态的机制之一发挥作用。通常，钙可以促进线粒体能量的产生。另一方面，钙超载可能会导致线粒体功能障碍和 ROS 过量产生。过量的 ROS 会导致 mtDNA 损伤，随后线粒体裂变/融合过程发生改变，导致细胞损伤、细胞凋亡、炎症反应，最终导致疾病进展。
近四年，线粒体功能障碍已被认为是肾结石病病因学的重要关键之一。电子显微镜已证实在结石形成者肾小管细胞扩大的线粒体内有钙致密沉积物，但未观察到晶体结构。其他几项研究也提供了证据，表明线粒体与草酸盐和 CaOx 晶体结合的能力。线粒体和 CaOx 晶体之间的结合机制被认为是通过线粒体蛋白质和脂质的过氧化作用介导的，这进一步促进了 CaOx 晶体的成核和聚集。由于在结石基质中发现了线粒体蛋白，并且在远端肾小管腔中发现了线粒体碎片和晶体，因此线粒体在肾结石形成的早期阶段受到了广泛关注。，表明它们在晶体成核中的作用。
尽管已发现线粒体直接与草酸离子和 CaOx 晶体相互作用，但之前对线粒体的研究仅关注它们在调节氧化应激和肾结石中常见的组织损伤中的作用。已发现 CaOx 晶体在肾小管细胞中诱导氧化应激，导致线粒体功能障碍和肾细胞损伤 (Khan, 2013, 2014)。肾小管细胞损伤和有缺陷的线粒体和其他细胞内细胞器是肾组织内 CaOx 晶体滞留加重的证据，这被认为是肾结石形成的重要步骤之一 。
遵循这一调查路线，之前关于肾结石疾病的几项研究因此探讨了线粒体损伤、ROS 过量产生、线粒体膜电位丧失和线粒体肿胀的影响。此外，CaOx 晶体可以诱导线粒体 O2− 的产生，从而进一步激活亲环蛋白 D (CypD)，这是线粒体通透性转换孔 (mPTP) 的组成部分。CypD 在打开此类孔中发挥作用，从而影响线粒体在 MIM 和 MOM 的通透性。此外，CaOx 诱导细胞色素 c 释放到细胞质，以进一步激活半胱天冬酶和相关信号通路，导致肾小管细胞凋亡（Jonassen 等人，2003 年；Niimi 等人，2012 年）。另一方面，mGSH 保持线粒体完整性和功能，还可以减少高草酸尿症条件下的草酸盐沉积。反之亦然，mGSH 减少会导致线粒体功能障碍，并可能导致 CaOx 肾结石的形成。
我们之前的线粒体蛋白质组研究强调了远端肾单位段的肾小管上皮细胞对 CaOx 晶体的反应。使用二维凝胶电泳，然后是四极杆飞行时间串联质谱仪 光谱法 (Q-TOF MS/MS)，在远端肾小管细胞暴露于 CaOx 晶体后，共鉴定出 15 种线粒体蛋白具有差异表达水平。其中，在维持线粒体功能（即丙酮酸脱氢酶、ATP 合酶和 NADH 脱氢酶）和细胞死亡（ezrin）方面发挥作用的蛋白质增加。结合其他大型蛋白质组数据集的综合生物信息学分析和功能验证，额外的结果表明线粒体功能障碍与氧化应激诱导的肾小管细胞损伤之间存在关联。
在 Randall 肾结石发病机制的斑块模型中也研究了线粒体。已经发现线粒体功能障碍不仅与肾小管损伤有关，而且通过降低 CaOx 结石形成者中单核细胞的线粒体功能而与免疫反应和炎症受损有关，导致晶体消除减少，从而进一步增强组织炎症。进行性组织炎症以及磷酸钙过饱和会诱导 Randall 斑块形成，最终导致肾结石的发展。为了应对受损的免疫反应和组织炎症以及间质斑块的发展，各种抗氧化剂或自由基清除剂和多糖化合物已被证明可作为治疗/挽救/预防肾结石形成的预防策略。
线粒体功能障碍参与肾结石病理生理的机制
草酸盐和钙可以改变线粒体活动，导致代谢状态的变化，这可能会导致线粒体在能量产生、ROS 调节和细胞内钙稳态方面的功能丧失或改变，所有这些都会影响线粒体生物发生（Veena 等人，2008 年；Hirose等，2010；Niimi 等，2012；Sun 等，2017）。线粒体融合和裂变之间的动态过程会产生各种副产物，其中大部分是线粒体片段和 ROS（Aparicio-Trejo 等人，2018 年；Janikiewicz 等人，2018 年；Geto 等人，2020 年）。如前所述，一些证据表明线粒体功能障碍与肾结石疾病的初始阶段有关。提出了线粒体功能障碍参与肾结石病理生理学的三种主要机制。
机制一 线粒体功能障碍可增加远端肾单位段肾小管腔内 CaOx 晶体的滞留。这些停滞的晶体随后形成石巢，这是由晶体聚集体产生的石头的中心部分，最终成为宏观石头。线粒体能量产生的损失或缺陷会增强 TCA 循环和 ETC 中的代谢过程，导致 ROS 产生增加和抗氧化酶减少（Brookes 等，2004；Chaiyarit 和 Thongboonkerd，2012；Peerapen 等，2018 ）。因此，过量的线粒体自由基会损坏线粒体膜（MIM 和 MOM）。结果，线粒体 ROS、细胞色素 c、钙和其他促炎因子进一步释放到细胞质中（Cao 等，2016；Fong-Ngern 等，2017）。高水平的细胞质 ROS 可诱导脂质过氧化，从而破坏细胞膜并进一步增强肾小管细胞顶端表面的晶体沉积（Cao 等，2016；Fong-Ngern 等，2017）。此外，凋亡信号级联被细胞色素 c 激活，这也会加剧肾小管细胞损伤，导致晶体粘附和肾内晶体滞留（Cao 等人，2016 年；Fong-Ngern 等人，2017 年）。累积的晶体可以进一步扩大和自聚集，从而形成结石（图 1）。
Figure 1 线粒体功能障碍在肾结石病的病理生理学中的作用：机制 I – 线粒体功能障碍诱导线粒体活性氧 (ROS) 和细胞色素 c 释放到细胞质中。脂质过氧化和凋亡级联反应会导致细胞膜损伤，从而增强远端肾单位段肾小管细胞顶端表面上的草酸钙 (CaOx) 晶体沉积。堆积的晶体可以进一步扩大和自聚集，从而形成结石。右图显示了宏观图，以展示所提出的机制发生的区域（与肾单位段相关）。
机制二 线粒体功能障碍导致细胞色素 c 的释放并诱导细胞凋亡，与细胞收缩、质膜起泡、细胞器凝聚和碎裂有关。此后，凋亡小体、细胞碎片和破碎的亚细胞器被释放到管腔中，然后与草酸盐和 CaOx 晶体结合，如多项研究所示。此外，在结石核心基质中发现了碎片化的线粒体和线粒体蛋白（即 48-kDa 蛋白），因此可能参与了结石病灶的形成。这些线粒体成分、膜碎片和其他细胞碎片可以直接作为远端肾单位结石病灶形成的原料，进一步促进晶体的成核、生长和聚集。大的聚集体可能会阻塞肾小管腔和/或迁移（通过肾小管液体流动）到J肾盂和肾盏形成结石（图 2）。
Figure 2 线粒体功能障碍在肾结石病的病理生理学中的作用：机制 II – 线粒体功能障碍导致细胞色素 c 的释放并诱导与细胞收缩、质膜起泡、细胞器凝聚和碎裂相关的细胞凋亡。产生的凋亡小体、细胞碎片和破碎的亚细胞器被释放到管腔中，然后可以与 CaOx 晶体结合。此外，破碎的线粒体和线粒体蛋白连同膜碎片和其他细胞碎片可以作为远端肾单位结石病灶形成的原料，进一步促进晶体成核、生长和聚集。大的聚集物可能会阻塞肾小管腔和/或迁移（通过肾小管液体流动）到花萼和骨盆形成结石。右图显示了宏观图，以展示所提出的机制发生的区域（与肾单位段相关）。
机制三 线粒体功能障碍可引发间质结石形成（兰德尔斑块模型）。在氧化应激条件下，线粒体损伤可导致线粒体膜完整性破坏，随后向细胞质释放 ROS、mtDNA、ATP 和碎片化线粒体。然后，这些成分可以诱导促炎细胞因子的分泌并触发炎症级联反应 (West, 2017)。响应线粒体损伤而分泌的促炎细胞因子也会将各种免疫细胞（包括组织巨噬细胞）募集到该间质区域。这些炎症细胞的迁移会导致组织炎症（Singhto 等，2013、2018）。此外，肾间质通常被磷酸钙过饱和，磷酸钙是肾结石中发现的另一种常见结晶化合物。与组织炎症一起，富含磷酸钙的 Randall 斑块开始形成（Khan，2013，2014）。这些斑块中的一些可以侵蚀到泌尿空间或肾盂，其中 CaOx 过饱和在结石形成者中非常常见。在该部位（主要位于肾乳头外侧），Randall 斑块可作为 CaOx 结石进一步发育或生长的病灶或茎 （图 3）。
图 3 线粒体功能障碍在肾结石病的病理生理学中的作用：机制 III – 线粒体损伤导致线粒体膜完整性破坏，随后释放 ROS、线粒体 DNA (mtDNA)、三磷酸腺苷 (ATP) 和碎片化的线粒体至细胞质。然后这些成分可以诱导促炎细胞因子的分泌，触发炎症级联反应，并进一步增强间质组织炎症。连同在肾间质中常见的磷酸钙过饱和，主要含有磷酸钙（羟基磷灰石）的兰德尔斑块开始形成。这些斑块中的一些可以侵蚀到泌尿空间或肾盂，其中 CaOx 过饱和在结石形成者中非常常见。在该部位（主要位于肾乳头外侧），Randall 斑块可作为 CaOx 结石进一步发育或生长的病灶或茎。右图显示了宏观图，以展示所提出的机制发生的区域（与肾单位段相关）。
结论和观点
总之，线粒体可以被认为是在肾结石病理生理学中起关键作用的中央细胞内细胞器。其主要功能的改变，包括能量产生和氧化应激和细胞内钙稳态的调节，与肾组织损伤和炎症反应有关，导致 CaOx 晶体成核、生长、聚集和沉积，这是肾结石形成的关键过程. 此外，线粒体碎片化产物和蛋白质可以直接与 CaOx 晶体结合，从而在结石病灶形成中发挥作用。除了管内晶体沉积和病灶形成外，线粒体功能障碍还通过增强组织炎症和磷酸钙（羟基磷灰石）间质沉积与 Randall 斑块形成有关。
应该指出的是，仅线粒体功能障碍不足以诱导肾结石形成，其机制是多因素的。例如，mtDNA 突变或有缺陷的核编码线粒体蛋白已在多种线粒体疾病中得到广泛研究，例如阿尔茨海默病、癫痫、线粒体肌病、脑病、乳酸酸中毒和中风样发作。然而，没有证据表明这些线粒体疾病与肾结石疾病之间存在联系。虽然 MELAS 综合征也影响肾细胞调节的酸碱平衡，但这种线粒体疾病的主要靶点是神经系统，而肾结石的形成需要肾内微环境，涉及多种因素，例如 CaOx 过饱和、磷酸钙等致病结晶化合物、尿流量低、结石抑制剂和促进剂的失衡、肾小管细胞损伤、氧化应激、炎症级联反应等。
基于上述致病机制，通过抗氧化剂恢复线粒体功能可能是预防新发或复发肾结石形成的有效方法。尽管已推荐使用抗氧化剂来保护线粒体活性并对抗各种疾病中的 ROS 过量产生，但其功效和不良事件仍不明确，需要进一步阐明。此外，先前的证据表明 CypD（Duann 和 Lin，2017）和 Bcl-2 相互作用蛋白 3（BNIP3）（Chaanine 等，2016；Peng 等，2019）通过线粒体膜的改变与线粒体功能障碍有关分别为活动和死亡信号释放。为了恢复线粒体功能并减少氧化应激，已经报道了使用环孢菌素 A和 N-甲基-4-异亮氨酸环孢菌素抑制 CypD 活化。此外，据报道，BNIP3 向线粒体的表达和易位是线粒体功能障碍的细胞死亡调节因子。这种蛋白质还涉及线粒体膜电位、线粒体转换孔形成、氧化应激、钙稳态和各种细胞类型的炎症（Gao 等，2020）。因此，治疗应用应考虑将抗氧化剂与其他有希望的化合物（即抑制 CypD、BNIP3 和其他相关分子的激活）结合起来，以预防未来新的和/或复发的结石形成。更重要的是，必须在大型队列中评估它们的疗效和不良事件。
尽管与氧化应激和 CaOx 晶体沉积相关的线粒体功能障碍的作用已被充分证明，但在结石形成者中也常见的过量钙的作用可能被忽视.最近，钙被认为是一种线粒体调节剂，涉及能量产生的几个步骤。另一方面，线粒体也在调节钙稳态中发挥作用。先前对乙二醇诱发的大鼠肾结石病的研究表明，只有 CaOx 晶体，而不是单独的草酸盐离子，才能削弱线粒体功能。然而，线粒体功能障碍、细胞内或线粒体钙浓度与结石发病机制之间的关联仍不清楚，应进一步阐明。这样做后，获得的研究结果可能会导致新的策略来应对结石期间的线粒体功能障碍， 发展并最终有效预防肾结石的形成。