北京大学医学部：是好是坏？内源分泌的外泌体可以携带功能性gRNA和Cas9蛋白
CRISPR/ Cas系统是一种有效的基因编辑工具，具有极大的临床应用潜力，尽管存在着递送、脱靶等问题仍需要解决。近日，来自北京大学医学部基础医学院鲁凤民、王杰课题组的研究人员发现，表达CRISPR/Cas9的细胞可以分泌携带功能性gRNA和Cas9蛋白的外泌体，这些外泌体可以向其他组织细胞输送基因编辑活性。外泌体的这一作用虽然可以避免病毒载体系统本身带来的副作用，但由于外泌体的广泛传递性也为这一系统的应用带来了新的风险。这项研究发表于Small杂志上（IF 10.856）。
CRISPR/ Cas系统来自于细菌和古细菌的适应性免疫系统，通过在靶基因组基因座处诱导DNA双链断裂（double-strand break，DSB）实现基因组编辑的目的。II 型CRISPR/ Cas系统是最简单的系统，由DNA核酸内切酶Cas9、CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）组成。在工程应用过程中，crRNA和tracrRNA融合成为单一的嵌合向导RNA（gRNA）。CRISPR /Cas9系统目前已被广泛用于编辑人、动物、植物和微生物的基因组。
CRISPR/ Cas9系统具有临床应用前景，但是缺乏安全有效的传递系统是一个问题。目前，CRISPR / Cas9系统通常是通过体内病毒载体递送，比如慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒（AAV）载体。然而，病毒载体的可能的细胞毒性、免疫原性和长期表达仍然是临床应用的障碍。最近，一些非病毒传递方法正在开发中，如脂质样纳米粒子、Cas9蛋白/gRNA核糖核蛋白复合物，但它们的稳定性、安全性和效率有限。外泌体是一种纳米级细胞外脂质双层囊泡，直径30 -150nm，广泛用于治疗和诊断应用。例如，肿瘤来源的外泌体在体外通过电穿孔的方式包装CRISPR / Cas9表达质粒，用作CRISPR / Cas9系统的载体。此外，一种脂质体杂交外泌体，所得到的杂合纳米粒子可以有效地将大的CRISPR / Cas9表达质粒包封并递送到靶细胞中。然而，使用CRISPR /Cas9表达质粒通常在靶细胞中对基因组DNA片段的整合出现非特异性编辑。为了更安全地使用CRISRPR / Cas9系统，一些研究报道了使用细胞外囊泡来递送Cas9 /gRNA复合物。例如，通过将Cas9蛋白与ARRDC1连接形成ARRDC1介导的微泡（ARMMs），以及通过用水泡性口炎病毒（VSV-G）的糖蛋白修饰供体细胞形成的携带RNPs的囊泡（VEsiCas），通过这些手段可以模拟病毒感染过程。此外，脱靶效应对CRISPR /Cas9系统的临床应用提出了另一个主要挑战。幸运的是，高保真Cas9（SpCas9-HF1）、增强特异性Cas9（eSpCas9（1.1））和超精确Cas9（HypaCas9）蛋白突变体可以显著减少的脱靶切割。所以用于临床实践的CRISPR /Cas9系统还需要更多的努力。
HepAD38细胞是一种常用的乙型肝炎病毒（HBV）稳定复制细胞模型。在这个细胞中，通过转染HBV特异性gRNA引导的CRISPR/ Cas9表达质粒可以抑制多达30％的HBV复制，即使CRISPR / Cas9转染效率仅为10％左右。外泌体可以传递microRNA / lncRNA和细胞蛋白用于细胞间通讯，因此研究人员认为，从HBV特异性CRISPR / Cas9表达质粒转染的细胞分泌的这种细胞外载体（EV）也能够提供CRISPR / Cas9系统，从而向周围的HepAD38细胞扩散这种基因编辑活性。因此，本研究旨在探索天然产生的内源外泌体携带和提供CRISPR / Cas9系统进行基因编辑的能力。
在本研究中，研究人员发现表达CRISPR / Cas9的细胞可以分泌内源外泌体，而gRNA和Cas9蛋白存在于这些外泌体中并从细胞中释放。进一步的实验证明，这些天然产生的内源性外泌体可用作载体，以递送功能性Cas9和乙型肝炎病毒（HBV）特异性gRNA，切割在HBV感染的HuH7细胞中的HBV DNA，或者利用人乳头瘤病毒（HPV）特异性gRNA中切割HeLa细胞中的HPV DNA。该研究证明了内源外泌体作为功能性gRNA和Cas9蛋白的安全有效递送载体的潜力。但是，内源外泌体介导的基因编辑活性向邻近和远端细胞或组织的递送，可能会进一步使CRISPR / Cas9系统的脱靶和安全性问题复杂化。
参考文献：Chen R, Huang H, Liu H, Xi J, Ning J, Zeng W, Shen C, Zhang T, Yu G,Xu Q, Chen X, Wang J, Lu F. Friend or Foe? Evidence Indicates Endogenous Exosomes Can Deliver Functional gRNA and Cas9 Protein. Small. 2019 Jul4:e1902686.
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