JCI：组织特异性外泌体生物标志物可监测器官移植后的免疫排斥反应

在器官移植中，亟需非侵入性生物标志物平台来监测免疫排斥反应。来自宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的研究人员假设移植组织将供体特异性外泌体释放到受体循环中，并且供体外泌体成分的定量和分析或可作为监测排斥反应的生物标志物平台。该研究在人类到小鼠异种胰岛移植模型中测试了这个假说，并在临床的胰岛和肾移植中进行了验证。在异种移植模型中，使用抗HLA（human-specific MHC class I）抗体进行长期随访定量检测受体血液中移植的胰岛来源的外泌体（仅在人胰岛的异种移植受体中可检测到）。使用抗HLA抗体偶联的磁珠纯化移植的胰岛来源的外泌体，其成分含有胰岛内分泌激素标志物胰岛素、胰高血糖素和生长抑素。免疫排斥导致移植的胰岛来源的外泌体信号的明显减少以及在高血糖出现之前外泌体miRNA和蛋白质组的不同变化。在临床的胰岛和肾移植中，具有各自组织特异性的胰岛β细胞和肾上皮细胞的供体外泌体在为期5年以上的随访受体血浆中均可确切检测到。总而言之，这些发现证明了外源移植物来源的外泌体作为生物标志物的潜力，为移植组织的条件状态提供了非侵入性窗口。

下面是文献的详细解读：

如图1，研究人员利用无胸腺的糖尿病小鼠移植人的胰岛的模型进行实验，利用Nanosight的光散射和荧光模式检测了外泌体的颗粒大小分布和MHC信号（anti–HLA-A和anti–HLA-C），所有进行胰岛移植的小鼠血液中均检测到了供体来源的 HLA外泌体信号。Western在外源胰岛样本中检测出微弱的HLA-A信号。接种白细胞诱导免疫排斥的胰岛移植组（R-xeno）血浆中外泌体的浓度与未诱导免疫排斥的胰岛移植组（N-xeno）无统计学差异，但是R-xeno组的血浆中HLA阳性的外泌体浓度较N-xeno组明显降低。

图 1.移植的人类胰岛释放供体来源的外泌体进入受体的循环中

接着发现，移植胰岛的小鼠在接种同源白细胞后HLA阳性外泌体信号明显下降（相比接种安慰剂组），并且在接种7天后空腹血糖急剧上升。葡糖糖耐受实验显示，8只动物中有3只在第6天葡糖糖耐受能力受损。在这些过程中外泌体的浓度和大小均无明显改变。组织学染色发现，在第5天由于大量的T细胞浸润，诱导免疫的移植胰岛受到破坏。诱导免疫反应后，血浆中T细胞外泌体（CD3阳性）一直维持在较高水平。

图 2.移植的胰岛来源的外泌体的表征可预示早期急性的免疫排斥反应

接着就是外泌体的分离提取和成分分析了，电镜图是必须的了。β细胞标志物FXYD2 在N-xeno组和人胰岛培养组的外泌体中与HLA-A共表达。供体与受体的MHC mismatch 使我们能够从受体血浆中纯化人胰岛细胞特异来源的外泌体。免疫排斥导致胰岛外泌体中内分泌激素胰岛素的下降。

图 3. 移植的胰岛源外泌体的纯化及其内含物的成分分析

研究人员对纯化的移植胰岛源外泌体（transplant islet–specific exosomes, TISEs） 与移植的胰岛（即其来源细胞/组织）进行的蛋白质和RNA成分的对比分析。筛选出了一堆差异表达的miRNAs。

Figure 4. TISEs的蛋白质和RNA成分分析

表 1.血糖量正常的移植胰岛小鼠的移植胰岛和TISEs表达丰度最大的25个miRNAs

表 2.与移植胰岛相比，TISEs表达差异最大的miRNAs

免疫排斥反应会导致TISE成分的改变。如与N-xeno组外泌体相比，R-xeno组外泌体angiopoietin-1 (A), HSC70 (B), hemopexin (C), 和 complement C3 (D) 四个蛋白表达有差异。

图 5. N-xeno组外泌体与R-xeno组外泌体相比差异表达的蛋白质

那么在临床上，外泌体与免疫排斥的相关性如何呢？研究人员取得5例Ⅰ型糖尿病移植胰岛的患者的血浆样本，我们可以看到在B–D 3个病人中, 供体HLA外泌体信号一直处于稳定水平，但是在病人 A中HLA外泌体信号在约100天后一直在下降，最终下降至0.35以下，血糖在800-1000天时急剧上升（而C肽/葡糖糖比值仍然正常）。同时该病人β细胞特异抗原谷氨酸脱羧酶65（GAD65）的抗体显著上升。

图 6. 人同种异体来源的胰岛移植的移植胰岛源外泌体的长时程定量分析

上面的临床相关性做完后，接着，研究人员检测了TISE成分是否可以在临床样本中纯化并检测？该患者由于在移植期的加速急性排斥反应而导致β细胞功能丧失（图7A）。首先，确认所有测试的血浆样品富含外泌体（图7B）。接下来，使用供体特异性HLA-A2抗体，证实移植后移植胰岛外泌体可检测到，但在移植前检测不到（图7C）。移植胰岛外泌体对FXYD2的共表达是高度阳性的（图7D），并显示了在移植后第2天血浆样品中胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和FXYD2蛋白的表达（图7E），与患者中高血糖症的校正相关（图7A）。RNA成分分析显示胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和FXYD2的表达，其在移植前样品中是不可检测的（图7F）。供体外泌体的血浆分析显示在产生免疫排斥反应后HLA-A2信号是阴性的（图7G），并且也在Western印迹上验证（图7H）。

图 7. TISE成分可在人同种异体胰岛移植的受体血浆中检测到

总之，这些研究结果表明，在临床胰岛移植中，可以使用供体HLA特异性抗体从受体血浆成功地进行供体胰岛外泌体定量和表征。类似于小鼠胰岛移植模型，供体胰岛外泌体共表达胰岛表面标记物，及移植胰岛的细胞特异性的组分。

该研究为临床上器官移植后的免疫排斥反应提供了十分有潜力的预后生物标志物。

参考文献：Vallabhajosyula P, Korutla L, Habertheuer A, Yu M, Rostami S, Yuan CX, Reddy S, Liu C, Korutla V, Koeberlein B, Trofe-Clark J, Rickels MR, Naji A. Tissue-specific exosome biomarkers for noninvasively monitoring immunologic rejection of transplanted tissue. J Clin Invest. 2017 Mar 20. pii: 87993. doi: 10.1172/JCI87993. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 28319051. IF=12.575