流动相中水的比例到底多高是太高？
反相色谱（RP-HPLC）是一种非常强大的分离模式，从小的有机酸到150 KDa的蛋白，它被应用于无数化合物的分析分离工作中。但是反相色谱有一个局限，就是在分析水溶性好（也就是亲水性强）的分析物时保留较弱，这时我们往往需要设计增加流动相中水相的比例以增加极性分析物和疏水固定相之间的作用，从而增加极性化合物的保留。分析物的极性越大，流动相中水的比例也需要更高。但是当我们在纯水相或接近纯水相的流动相条件下长时间使用常规C18时，会发现分析物的保留时间会发生逐渐或者突然变小而出现结果不能重现的问题。所以色谱研究人员经常有以下的问题：
“为什么纯水条件下会发生这个现象？”
“流动相中水的比例到底多高是可以接受的？”
“但是为什么又有一些C18固定相的反相色谱柱在纯水条件下没有保留时间减少的问题？”
对于常规的C18（或其他疏水固定相）色谱柱在100%水的流动相中会逐渐或突然减少分析物的保留时间这个现象，早期的解释是键合在硅胶表面的C18固定相在纯水条件下的改变了C18的空间排布，即由原来的垂直在硅胶表面变成了平躺在硅胶的表面，也就是常说的“固定相塌陷”（Phase collapse），如图1。固定相平躺在硅胶表面就减少了固定相和分析物之间的作用，分析物的保留时间也就因此减少。
图1 (a)在水/甲醇中的固定相状态；(b)纯水相中的固定相状态
到了90年代的后期，实验证据的出现让许多研究者接受了另一种新的理论解释，也就是保留时间的减少实际是由于固定相的颗粒孔“去湿“（Dewetting）现象所造成。也就是说水相和疏水的固定相表面之间产生高的表面张力，因此流动相会很容易被逐出布满疏水固定相的填料的多孔空间。如果颗粒的孔内不再有液体，固定相和分析物相互接触的机会也减少了，进而造成两者之间相互吸引力的减少，分析物的保留时间自然缩短。实验证实当C18的固定相由高有机溶剂突然转换100%水溶剂时，流动相在色谱柱中的体积明显的降低，而流动相在色谱柱内的体积减低的幅度和分析物的保留时间的减少有着密切关联。
图2 （a）“湿润”状态；(b)“去湿”状态
影响溶剂被逐出颗粒孔外有以下几个主要因素：颗粒的孔径大小，固定相的种类，柱温，以及柱压（对于柱压这个因素，我们也可以说“去湿”与颗粒大小和流速有关）。Young和 Laplace的方程式（如下）经常用来解释不同参数影响去湿的现象。这个方程式提供了以下几个参数的关系：进入毛细管所需的压力(P)，液体在表面接触的角度(θ), 液体的表面张力(γ)，和毛细管的半径(r)。
因为水在键合疏水固定相的硅胶表面接触的角度大于90°，所以要将水挤进到硅胶颗粒的孔中是需要正压。在正常的液相分析中，将水推进硅胶颗粒孔中的压力是大于流动相经过整支色谱柱硅胶表面所需的压力。所以当柱压突然停止时，孔内压力大于孔外压力，水的流动相就自然由疏水固定相的颗粒孔内被排出来。当再使用这支色谱柱时而颗粒孔内没有液体时，固定相和分析物接触的体积大大的减少，分析物的保留时间自然就很明显的减少。但是当固定相变得比较不疏水时，水和硅胶表面的接触角度就会减少。一旦当接触角度小于90°, 由上面的方程式得到进入毛细管所需的压力（P）就成为负数，表示孔外压力大于孔内压力，流动相会自动地进入颗粒孔内。这就是我们说的“湿润”（wetting）颗粒孔。上面的方程式也同时告诉我们颗粒孔径的大小（r）也会影响到压力，当孔径越小，要将流动相推入孔内所需要的压力也就越大。
虽然上面方程式提供一个很好的理论解释，但是因为硅胶孔的结构并非很对称，颗粒大小也不是很均匀，而且孔内的固定相也包含了没有键合的游离硅醇基团，不同密度的固定相（例如C18）和被封端的硅醇基团（例如TMS封端）。所以当我们希望准确回答“流动相中的水的比例到底多高是太高？”时，色谱方面的文献往往无法给出具体的答案，但是它们给了我们非常有用的数据来判断趋势。比如 Bidlingmeyer 和 Broske发现对于一种常规的C18色谱柱，如果孔径大小是80 Å时，在纯水流动相条件下保留时间大幅减少（约80%），而孔径是150 Å时，对保留时间则没有影响。如果是带有苯基的固相相，即使是80 Å的孔径，保留时间也毫无影响。
由于每个厂家C18色谱柱都不尽相同，而且有很多不同的参数会影响色谱柱的耐水性能，很难有一个指标可以很容易的来决定到底某一种色谱柱能承受多少的水，所以最好的方法就是直接测试来决定到底流动相含有多少水是太多。以下是简易的实验：
（1）首先使用高甲醇或是乙腈的溶剂平衡色谱柱，让颗粒孔内保持完全“湿润”（wetting）的情况，一般使用20倍柱体积的流动相以一般流速冲洗色谱柱就足够了；
（2）然后准备好的含水流动相（或是纯水）和分析样品（含两种或者三种化合物的混合物），需要确保样品在这种流动相条件下可以得到合理的保留时间，接下来每一分钟进样一次一直到色谱柱达到平衡，保留时间稳定后几分钟，然后停泵；
（3）10分钟后，重新启动泵，再度进样并比较流动相停止前与后的保留时间。如果有明显的减少，就表示在这个比例的富水流动相有严重的“去湿”（Dewetting），这种色谱柱就必须避免在这个比例的水（或更高）的流动相条件下操作。
图3是使用两种不同的C18柱所得到测试的结果。第一种是常规的C18柱，第二种是带有亲水性的C18柱（AQ-C18）。两者都是硅胶基质的C18柱，但是AQ-C18固定相的设计是避免在纯水条件下产生“去湿”（Dewetting）的现象，也就说AQ-C18可以在纯水下操作。在停止流动相的前和后的10分钟内每一分钟进样一次，而中间将流动相停止10分钟。一开始时，保留时间比较短，主要是色谱柱还没有由50/50有机相/水到100%的水达到平衡。一旦达到平衡，可以看到两种C18色谱柱的保留时间很相近。但是将流动相停止10分钟后的进样，就看到非常不同的结果。常规C18的保留时间大幅减少（减少75%），而AQ-C18 的保留时间基本没有太大变化。
图3 停泵10 min前后尿嘧啶保留因子的测定
如果发现反相柱因为储存太久造成保留时间明显减少时，很可能是因为硅胶颗粒柱床干涸，也就是已经“去湿”（Dewetting）。这种“去湿”并不意味着柱子发生不可逆的损坏，我们可以尝试使用有机相比较高的流动相冲洗色谱柱，例如50/50的乙腈/水，以低流速冲5-10分钟。一旦流动相能重新“湿润”（wetting）颗粒的孔，色谱柱基本就可以恢复到原来的保留情况。如果我们在使用常规C18柱开发时，想要确定是否存在由于使用的流动相中水的比例太高而使色谱柱“去湿”（Dewetting）的风险时，可以利用上述的方法测试含不同比例的水的流动相来快速鉴定 。
如果想避免这种情况，另一种选择是使用极性基团修饰过的C18色谱柱，这类色谱柱允许在100% 水相的条件下操作。使用带有极性基团的C18色谱柱对分析极性化合物还有另一重的优势，那就是这类色谱柱除了提供C18的疏水作用外，还有其他的极性作用力，可以增加对极性化合物的保留。因为有了可以在纯水条件下操作和极性作用力的双重优势，带有极性的C18柱也就越来越多使用在分析极性化合物。下表是部分可以在纯水下操作的反相色谱柱供参考。其他不在表中可在纯水下操作的色谱柱，可以咨询不同厂家。
本文比较详细地回答前言中提到的关于C18使用高比例水相时的三个问题，也介绍了发生“去湿”现象时的处理方法，同时对部分市面上耐水的AQ类色谱柱的技术做了分类，希望能帮助大家更系统地了解这方面的基础知识。
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