二代测序方法：DNA测序之靶向重测序

二代测序方法：DNA测序之靶向重测序 - 目录

• 1. 靶向重测序

• 2. 靶向测序技术

• 2.1 多重扩增子测序

• 2.2 杂交捕获测序

• 2.3 小结

• 3. 杂交捕获测序数据质量评估

• 4. 基于测序的基因分型方法

• 5. 基于大型基因组(> 5 Mb)测序的基因分型

• 6. 靶向基因测序

• 6.1 靶向基因测序简介

• 6.2 靶向基因测序的优势

• 6.3 预设计的靶向基因panel

• 6.4 定制靶向基因测序解决方案

• 6.5 扩增子测序与目标富集的优点

NGS技术正逐年成熟，这使得全基因组测序的成本越来越低，但是对全基因组进行测序后得到的极其庞大、繁杂的数据量的分析工作并没有随之一起变得更加简单。相反，测序技术的发展出现了两个极端的方向：一种是大而全的全基因组测序，一种是小而精的靶向重测序。

1. 靶向重测序

靶向重测序即将一组基因或基因组区域分离出来并对其进行测序。使用二代测序（NGS）的靶向方法让研究人员能够将时间、费用和数据分析集中在感兴趣的特定区域。这种靶向分析包括外显子组（基因组的蛋白质编码部分）、感兴趣的特定基因、以及基因或线粒体DNA中的目标区域。

相比于全基因组测序（WGS），靶向重测序技术直接从样品中对感兴趣的基因组区域进行分离测序。这种方式能够更加高效且经济地发挥NGS技术的优势，后续的分析速度也会有跨越性的提升。比如外显子组仅占基因组的1%左右，但却包含了绝大部分的已知致病突变，将外显子区域分离出来后单独进行测序，后续的分析就能降低99%的工作量，极大的加快了分析的速度。

靶向测序将感兴趣的基因组区域通过捕获试剂盒进行富集后测序，利用较少的数据量就能得到超高的灵敏度和准确度，实现变异位点的快速筛选。相较全基因组测序和全外显子测序，靶向测序能够聚焦所关注的区域，去除冗余数据的干扰，同时最大限度地利用测序reads，测序成本低且测序深度深，尤其适用于在临床应用中样本量少时的选择。

在遗传突变、肿瘤筛查等领域，靶向重测序所能达到的灵敏度也是全基因组测序完全无法实现的。由于靶向重测序在测序前就对基因的目标区域进行了分离与富集，目标区域的大幅减少可实现5000×甚至更高的测序深度。测序深度的提高意味着更高的灵敏度（能够检测低频率的变异），其检测极限低至0.1%。

2. 靶向测序技术

靶向测序的方法主要分为多重扩增子测序和杂交捕获测序两条技术路线。

2.1 多重扩增子测序

多重扩增子测序即针对感兴趣的目标区域，设计多重PCR引物进行扩增富集并进行测序的技术。通常适用于检测几十到几千个位点，或几十kb以下的区域。

2.2 杂交捕获测序

通过设计与目标片段互补的生物素化探针，使其与含目的基因的片段进行杂交，以达到将目的基因片段富集后进行高通量测序的目的。根据支持物的不同，探针杂交捕获技术分为液相杂交与固相杂交两种。固相杂交由于其在花费与操作上的劣势，已基本被淘汰；液相杂交是在溶液中，目标片段和带有生物素标记的探针直接杂交，然后利用被链霉亲和素包裹的磁珠对杂交了生物素探针的片段进行吸附。洗去游离DNA后，将富集得到的DNA进行扩增，构建高通量测序文库。

杂交捕获测序，目前应用的主要是液相杂交捕获测序，即基于碱基互补配对原理，设计合成核酸探针，对DNA文库进行基于液相环境的目标区域杂交富集，并进行测序。液相杂交捕获测序可适用于几kb到上百Mb的基因组目标区域的检测，可检测SNV，InDel，CNV，SV，基因融合等变异。

2.3 小结

扩增子捕获测序助力临床研究加速

对临床或转化研究而言，检测不仅要准确，还要快速并且经济。相比于扩增子捕获法，杂交捕获的实验过程过于复杂繁琐，且手动操作时间过长，过多的人工干预流程可能会对实验结果造成不可控的影响，这对于临床而言是非常致命的。同时，扩增子捕获技术实验流程的简化极大的降低了操作人员的专业门槛，使更多的人能够完成实验，彻底解放了人手不足的风险。

扩增子捕获测序作为全基因组测序的补充技术是非常有用的，它大大简化了实验流程和分析目标。该技术已被证明是一个快速、有效的技术，并在新一代高通量测序中发挥独特之处，已经产生了许多令人兴奋的新发现，应用领域也越来越广泛。

3. 杂交捕获测序数据质量评估

目标区域捕获测序的数据质量主要通过以下数据指标来评价：目标区域覆盖度、捕获特异性、目标区域覆盖均一性等。目标区域覆盖度就是指对于想要检测的目标区域，能够被测到的比例是多少。最理想情况是感兴趣的目标区域都能被覆盖到。

4. 基于测序的基因分型方法

过去，基于芯片的单核苷酸多态性(SNP)筛查方法是分析许多植物和动物的性状并将其与基因组区域建立关联的首选方法。由于测序成本持续下降，研究人员正在开发利用新一代测序(NGS)技术进行基因分型的新方法。基于测序的基因分型或新一代基因分型是一种用于发现新的动植物SNP位点并进行基因分型研究的基因筛查方法。对于某些应用（例如基因型筛查及基因定位），基于测序的基因分型为基因变异研究提供了一种比芯片成本更低的替代方法。

基于测序的基因分型的优势：

• 可对众多样本的预定基因变异区域测序

• 为某些应用提供较低的单位样本成本

• 与芯片相比，可减少预设位点的偏好性

• 可检测除SNP以外的变异，包括微小插入、缺失以及微卫星变异

• 在参考基因组缺失的情况下，支持样本对比分析

• 支持基因定位、筛查回交线、纯化测试、构建单体型图、关联定位以及用于植物研究的基因组选择。

目前已开发出多种基于测序的基因分型方法。富集方法对植物很有效，因为植物通常包括重复的基因组区域。限制性酶方法适合研究没有基因组先验知识的物种。

5. 基于大型基因组(> 5 Mb)测序的基因分型

基于测序的基因分型是一种经济高效的方法，适用于具有复杂基因组或资源有限的群体。使用的技术包括基于扩增子的靶向测序、以杂交为基础的富集测序以及基于序列的限制性酶简化基因分型。

如果要使用此方法获得最佳结果，Illumina建议具备以下条件：

• 参考基因组

• 多样性丰富的样本

• 多样本之间的微调覆盖

• 变异检出格式(VCF)文件转换器

• 支持杂合子检测和冗余校验中的模糊容忍度，以最大限度减少误报

6. 靶向基因测序

6.1 靶向基因测序简介

在分析指定样本的特定突变时，靶向的基因测序panel是有用的工具。重点panel包含了一组精选的基因或基因区域，它们与正在研究的疾病或表型有着已知或疑似的关联。在购买基因panel时，可挑选预先选定的内容，或定制设计内容，从而将感兴趣的基因组区域包含在内。

二代测序技术（NGS）为评估感兴趣的靶向基因提供了可扩展性、高速和分辨率。可平行评估多个样本的多个基因，与多次进行单独分析相比节约了时间，且降低了成本。与全基因组测序等更广泛的方法相比，靶向基因测序能生成更小、更易于管理的数据集，使分析更加轻松。

6.2 靶向基因测序的优势

• 深度测序重要基因或感兴趣的区域（500–1000倍或更高），实现罕见变异的鉴定

• 为研究疾病相关的基因提供一种经济高效的探索方案

• 带来准确且容易阐释的结果，可鉴定等位基因频率低（低至5%）的变异

• 在单次检测中实现新的致病性突变或遗传性突变的可信鉴定

6.3 预设计的靶向基因panel

预设计的panel包含了与疾病或表型相关联的重要基因或基因区域，这些基因来自文献和专家的指导。通过专注于最可能有相关性的基因，该panel可以节省资源并最大程度地减少数据分析的工作量。预设计的panel可用于研究各种疾病，例如癌症、遗传性疾病、心脏病和自闭症。

6.4 定制靶向基因测序解决方案

Illumina支持两种靶向测序方法：扩增子生成和目标富集。
扩增子测序： 使用高度多重的寡核苷酸库来扩增并纯化感兴趣的区域。该方法让研究人员可以根据选用的文库制备试剂盒，在单次运行中对几个到数百个基因进行测序。
目标富集： 感兴趣的区域通过与生物素标记的探针杂交而被捕获，之后通过磁珠沉淀而被分离。视具体的实验设计而定，目标富集可捕获20 kb–62 Mb的区域。

6.5 扩增子测序与目标富集的优点

通过定制设计，研究人员可以靶向与其特定研究兴趣相关的基因组区域。定制靶向测序非常适合用于检查特定通路中的基因、或作为全基因组关联研究和全基因组测序的进一步实验。

扩增子测序	目标富集
基因内容较小，通常小于50个基因	基因内容较大，通常大于50个基因
非常适合分析单核苷酸位点变异和插入/缺失	更全面地分析所有变异类型
工作流程更经济、更简便	方法更全面，但手动操作时间和周转时间更长*

*周转时间为文库制备分析时间（从DNA到完成文库）。

参考阅读：
二代测序方法集锦（二）—DNA测序之靶向重测序
靶向重测序简介
追根溯源：细说靶向重测序与扩增子捕获技术