高效类酶活性碳点用于抑制体内氧化应激 | Applied Materials Today
碳点 (CDs)，作为一种新型的碳基纳米材料，以其超小尺寸、高稳定性和高生物安全性等优点，广泛应用于传感、器件、药物载体及疾病诊疗等领域中。近年来，有研究报道显示CDs具有特殊的类酶活性，表现出产生或清除自由基 (ROS) 的能力。其中，实现或提高CDs清除ROS的策略主要有两种：1）通过引入大量的含氧官能团，利于ROS与材料之间形成加和物和电子转移；2）通过掺杂金属离子或杂原子促进电子转移。然而，上述两种策略难以实现对多种自由基的同时、高效清除且存在一定的生理毒性。因此，如何构建无金属掺杂的CDs实现体内ROS的高效、快速清除仍有待进一步探索。
全文速览 ·
基于此，安徽大学毕红教授、中科院宁波材料技术与工程研究所吴爱国研究员、合肥工业大学查正宝教授合作研究了一种具有高效类酶活性的无掺杂CDs (e-CDs)。在体外实验中，合成的e-CDs对各种阴/阳离子自由基均表现出良好的清除能力。此外，通过构建d-半乳糖诱导的衰老小鼠模型，证实了e-CDs具有良好的抗衰老能力。该工作为进一步通过简便、高效的合成策略开发各种新型具有高效类酶活性的CDs提供了有价值的见解，并为纳米材料在抗衰老药物中的应用提供了新的思路。
该研究成果以Inhibition of oxidative stress in vivo through enzyme-like activity of carbon dots为题发表在 Applied Materials Today 上。安徽大学董晨博士为该文的第一作者。
图文解析 ·
透射电子显微镜 (TEM) 图像显示e-CDs呈单分散状态，平均直径为4.8 nm (图1a)。随后，进一步利用傅立叶变换红外吸收光谱仪 (FT-IR) 和X射线光电子能谱 (XPS) 研究了e-CDs的化学组成与结构。FT-IR图谱中 (图1b)，位于1347 cm-1和1588 cm-1处的特征峰分别对应于C-O和C=O键的伸缩振动，而3389 cm-1处的特征峰为-OH的伸缩振动。XPS分析结果表明e-CDs主要由碳 (285.3 eV) 和氧 (530.2 eV) 两种元素组成，对应的原子含量分别为68.1%和31.9% (图1c)。此外，C 1s 的高分辨能谱 (图1d) 具有位于284.6 eV、286.7 eV和288.9 eV的特征峰，可分别归属于C-C/C=C、C-O和C=O键；O 1s的高分辨能谱 (图1e) 具有C=O (531.8 eV)和C-O (535.7 eV) 键的对应信号峰。上述FT-IR 和XPS结果表明，e-CDs 表面由丰富且多样的官能团与化学键组成。UV-vis光谱中出现了210 nm和283 nm的特征峰，可分别归属于π-π⁎和n-π⁎跃迁 (图1f)。
图1. e-CDs的 (a) TEM图像, (b) FT-IR和 (c) XPS光谱; (d) HR XPS C1s和 (e) O1s谱及其拟合结果; (f) e-CDs的UV-vis光谱及相应的PL光谱。
通过标准MMT比色法对e-CDs的细胞毒性作了初步评价 (图2a)。从结果可以看出，e-CDs分别与HepG2细胞和HUVEC细胞共培育24 h后，随着 e-CDs 浓度的不断增大，细胞活性略有下降，但两种细胞的存活率均高于80%，该结果说明e-CDs 对人源正常细胞和癌细胞均表现出较小的细胞毒性。此外，LDH法也是一种检测样品细胞毒性的方法，如图2b所示，e-CDs造成HepG2细胞和 HUVEC细胞内的LDH 释放量呈浓度依赖性，最大释放量均低于 300 U L-1，该结果也进一步证明了e-CDs 对细胞膜的损伤较小，这与 MTT比色法测定的结果保持一致。随后，利用H2O2诱导氧化应激评估e-CDs是否能够保护HUVEC细胞 (图2c)。用300 μmol L-1H2O2培养HUVEC细胞，可使细胞活力降低约50%。而在培养基中加入e-CDs后，细胞活力梯度增加。当e-CDs浓度增加到300 μg mL-1时，与对照组相比，细胞存活率没有显著差异，表明在培养过程中几乎没有产生ROS。此外，DCFH-DA荧光探针、活/死细胞染色和流式细胞仪测试结果也进一步证实了e-CDs对H2O2诱导的氧化应激损伤具有明显的保护作用 (图2d-f)。此外，e-CDs对HUVEC细胞中丙二醛 (MDA)、谷胱甘肽 (GSH) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 水平的影响，表明e-CD具有良好的ROS清除作用，能保护细胞免受氧化应激损伤 (图2g-i)。
图2. (a)不同浓度e-CDs共孵育HUVEC和HepG2细胞24 h后的MTT结果; (b) 不同浓度 e-CDs处理的HUVEC和HepG2细胞释放LDH的结果; (c) e-CDs对氧化应激HUVEC细胞的保护作用; (d) DCFH-DA探针对HUVEC细胞的荧光染色图像; (e) 分别用Calcein-AM和PI染色的活、死HUVEC细胞荧光图像; (f) 流式细胞仪检测ROS水平; e-CDs对HUVEC细胞中 (g) MDA, (h) GSH和 (i) SOD的影响。
受体外氧化应激抑制作用启发，通过构建d-半乳糖诱导的氧化损伤小鼠模型评价e-CDs体内抗衰老能力 (图3a)。连续口服e-CDs治疗30 d后，采集各组小鼠的血液及相应组织。从测定d-半乳糖诱导的氧化损伤小鼠血清和肝脏中MDA、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、过氧化氢酶 (CAT) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 水平结果来看，随着e-CDs浓度的增加，小鼠的氧化损伤得到有效缓解 (图3b-e)。与此同时，免疫组化染色结果显示d-半乳糖可加速小鼠衰老，而e-CDs可减少凋亡蛋白，增加抗凋亡蛋白的形成，缓解小鼠脑/肝脏组织细胞凋亡，从而缓解机体衰老 (图3f,g)。随后，进一步观察并分析了各组小鼠皮肤组织的病理形态 (图3h,i)。可以清楚地观察到对照组中小鼠皮肤弹性纤维排列整齐，细长，呈交织或网状。相比之下，d-半乳糖诱导的氧化损伤小鼠皮肤组织中胶原纤维明显减少，排列不规则，部分区域破碎稀疏，是老龄化特征的典型表现。经e-CDs治疗后，小鼠皮肤组织中的胶原纤维得到一定程度的改善。胶原纤维多呈波状，排列有序，密度提高。说明e-CDs治疗可在一定程度上减轻d-半乳糖所致小鼠皮肤组织的老化损伤，维持正常的生理结构和形态。
图3. (a) 小鼠氧化损伤模型构建示意图; e-CDs对氧化损伤小鼠血清和肝组织中 (b) MDA, (c) GSH-Px, (d) CAT和 (e) SOD水平的影响; e-CDs对氧化损伤小鼠 (f) 海马体和 (g) 肝脏中Bax、Bcl-2蛋白表达的影响; e-CDs对氧化损伤小鼠皮肤组织中 (h) 弹性纤维和 (i) 胶原纤维含量的影响。
本文来源：碳点之光