抗凋亡蛋白NAF-1和iASPP相互作用，促进癌细胞的凋亡
Chemical Science
2019, 10
IF：9.614
Background
蛋白-蛋白质相互作用(PPI)是细胞凋亡、自噬和坏死等多种细胞死亡途径的核心。影响参与这些途径的特定的PPI可以改变细胞的命运。例如，抑制抗凋亡蛋白的相互作用可能导致凋亡细胞死亡.我们发现iASPP和NAF-1是肿瘤细胞死亡机制的重要抑制因子，它们相互作用，参与细胞凋亡调控，可作为诱导癌细胞凋亡的靶点。与iASPP 764-780 序列相对应的肽稳定了NAF-1结构，抑制了NAF-1与iASPP的相互作用，抑制了核孢素诱导的人乳腺癌细胞凋亡和P53激活诱导的前列腺癌。在表达不同水平和/或变异的NAF-1的乳腺癌细胞中，iASPP 764-780的细胞死亡抑制水平发生了改变，表明肽活性与NAF-1是相关的。我们认为iASPP和NAF-1之间的相互作用是癌细胞凋亡激活所必需的。这种相互作用揭示了癌细胞细胞死亡的新途径，并为激活恶性肿瘤凋亡的新型抗癌药物的开发开辟了新的探索途径。因为NAF-1和iASPP以前被证明参与了调节细胞的氧化应激能力，我们提出设计分子来调节其PPI可能是控制癌症细胞增殖、抑制细胞凋亡和细胞氧化状态的重要研究途径。
Binding of NAF-1 to iASPP in cancer cells
确定NaF-1是否与iASPP相互作用体内我们对MCF-7人上皮性乳腺癌细胞进行了双分子荧光互补(BIFC)分析。因为NaF-1是一种二聚体，我们可以利用其自身的二聚作用作为BIFC检测的阳性对照。当NaF-1-yfc和NaF-1-yfn融合蛋白在MCF-7细胞中共同表达时，它们表现出BIFC信号，该信号主要定位于ER(图1B-D)。相反，在MCF-7细胞中共表达NaF-1-yfc和iASPP-yfn融合蛋白时，未检测到BIFC信号。（图1B-D)。另外，在非特异性激酶抑制剂stauroporine(STS，1μm)作用1小时后，细胞中检测到BIFC信号在细胞内共表达分裂的NAF-1-YFPc和iASPP-YFPn融合蛋白，这是一种激活细胞凋亡并引起氧化应激的非特异性激酶抑制剂。联合表达NAF-1-yfc和iASPP-yfn的STS处理细胞所获得的BIFC信号部分定位于ER(图1B-D)。综合起来，调查结果显示在图1证明在STS激活凋亡后，NAF-1与癌细胞中的iASPP相互作用，这种相互作用部分发生在ER。
Mapping iASPP Ank–SH3 interactions with NAF-1
NAF-1与HLT-iASPPAnk-SH3结合相互作用，不与对照组相互作用。（2A)这些结果表明，iASPPAnk-SH3在体外结合NAF-1。为了确定iASPP的哪些区域与NAF-1相互作用，我们使用肽阵列来绘制iASPP中的NAF-1结合位点(图2B）。筛选NAF-1结合91个来自iASPP的91个重叠肽。在这些候选物中，67个肽来自iASPP Pro结构域，24个肽来自iASPP Ank-SH3。NAF-1结合来自iASPPAnk-SH3的两个肽，iASPP 739-753，和iASPP 764-778(图2B和E）。突变体NAF-1H114C是一种重要的控制蛋白，只结合iASPP 764-778，但不结合iASPP 739-753(图2C和E）。因此，我们专注于研究iASPP764-778与NAF-1的相互作用。通过肽阵列扫描实验，我们用丙氨酸系统地替换了iASPP764-778的每个残基，并测试了它们与NAF-1的结合。结果表明，iASPP764-778和1与NAF-1：E772、F773、D775和E776的相互作用是最重要的。DCA和丙氨酸扫描都发现iASPP F773对这种相互作用很重要。PPP对接模拟工具Z-Dock被进一步被用来构建NAF-1和IASPP之间的结合复合物。（图2F)。
iASPP 764–780 inhibits iASPP interaction with NAF-1 and stabilizes the cluster of NAF-1
由于NAF-1簇的稳定性会影响细胞增殖，我们测试了NAF-1簇在iASPP 764-780肽不存在或存在的情况下的稳定性.IASPP 764-780肽稳定NAF-1团簇，80%的簇在800 min后仍与NaF-1结合(相反，不存在IASPP 764-780肽的情况下500 min后团簇未与NAF-1结合（图3C)
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iASPP 764–780 inhibits apoptosis in cancer cells in a NAF-1- dependent manner
IASPP和NaF-1均能抑制癌细胞凋亡.iASPP和NaF-1在细胞凋亡激活时相互作用(图1)。由于iASPP 764-780抑制iASPP与NaF-1的相互作用 (图2A)。检测iASPP 764-780肽对癌细胞凋亡激活的影响。IASPP 764-780肽能穿透MDA-MB-231细胞，但对细胞没有杀伤作用。IASPP 764-780肽对STS诱导的MAD-MB-231球体凋亡有抑制作用。（图4A和B)。由于该肽来源于iASPP，iASPP也能结合和抑制p53诱导的细胞凋亡，我们将该肽导入P53缺失的PC-3前列腺癌细胞中.该肽对STS诱导的PC-3球体细胞死亡有明显的抑制作用。（图4D)。为了验证该肽对肿瘤细胞凋亡的抑制作用是否与NAF-1的表达有关，我们使用了4种不同表达NAF-1的乳腺癌细胞株：野生型，NAF-1抑制或过表达，H114C突变体过表达。IASPP 764-780肽(30μM)可抑制MAD-MB-231球体细胞死亡，抑制MAD-MB-231球体的凋亡或高表达的NaF-1。iASPP764-780肽(30μM)抑制了MDA-MB-231球状体在WT或过度表达NAF-1水平下的细胞死亡。在过度表达H114C突变的球状体中，抑制作用更大；在NAF-1表达被抑制的MDA-MB-231细胞中没有观察到抑制这些结果与细胞内iASPP 764-780肽功能与NAF-1的存在和/或功能相关的假说是一致的。
iASPP和NaF-1均抑制细胞凋亡，参与调节氧化应激，两者均与抗氧化蛋白Nrf 2有关。Nrf 2是氧化应激反应的主要调节因子之一，可作为癌细胞增殖的驱动力或抑制因子。Nrf 2的活性受Keap 1的调节，可诱导Nrf 2的泛素-蛋白酶体降解。Nrf 2的降解在氧化应激下迅速降低，导致Nrf 2的积累。IASPP通过与其抑制剂Keap 1结合而激活Nrf 2，导致肾细胞癌的ROS降低，细胞死亡减少，耐药率增高。低NaF-1表达的细胞显示ROS增加,高水平的Nrf 2蛋白和活性。由于这两种蛋白都与Nrf 2有关，我们推测这里描述的新发现的相互作用可能调节Nrf 2的活性。通过这样做，iASPP-NaF-1相互作用可能允许细胞以氧化应激依赖的方式经历或抵抗凋亡。当NaF-1与iASPP结合时，Keap 1可以自由地抑制NRF-2的活性，从而增强氧化应激。在iASPP 764-780肽存在下，iASPP与NaF-1的相互作用受到抑制，iASPP可与Keap 1自由结合，从而导致Nrf 2的积累和激活，降低ROS水平，抑制STS诱导的细胞凋亡。(图5).
虽然iASPP和NAF-1都是抑制细胞凋亡的重要抑制剂，但它们的相互作用驱动了癌细胞的凋亡，揭示了高度复杂的细胞死亡调节网络中的另一个机制。因此，抑制NAF-1-iASPP相互作用的化合物可以作为抗细胞过度凋亡引起的疾病(如神经退行性疾病)的先导化合物。
The anti-apoptotic proteins NAF-1 and iASPPinteract to drive apoptosis in cancer cells
doi: 10.1039/c8sc03390k
PMCID: PMC6349067
PMID: 30774867