通过全基因组测序及遗传作图的方法定位小麦条锈菌无毒基因簇

由条形柄锈菌小麦专化型Puccinia striiformis f. sp. tritici (Pst)引起的小麦条锈病是制约我国小麦生产的重要病害之一。目前对该病害的毒性变异分子机理尚不清楚，解析毒性变异关键因子可以为该病害的防治提供坚实的理论基础。

国内外学者对病原菌毒性变异的机理已有深入研究。20世纪70年代初，Flor在“基因对基因学说”中揭示，在植物病原与寄主的相互作用中，寄主的抗病反应是其抗病基因（R）产物识别病原物的无毒基因形成的。寄主抗病基因对病原菌无毒基因的识别决定了寄主的抗病反应，病原菌无毒基因的变异使其无法被寄主抗病基因识别，从而造成寄主抗病性失效。因此，鉴定无毒基因是明确病原菌毒性变异的关键。研究表明，植物病原菌中无毒基因是导致毒性变异的关键因子。多种锈菌中无毒基因已克隆，但在小麦条锈菌中尚未有无毒基因克隆的报道。美国学者Jin 等人于2010年首次报道了小麦条锈菌的有性生殖阶段，为鉴定小麦条锈菌无毒基因提供了新的思路，即利用遗传作图的方法定位无毒基因。目前虽然已有多个课题组采用此方法，但是由于所用的分子标记太少、参考基因组序列质量不高等原因，均未能精确定位小麦条锈菌的无毒基因。为了克服这些缺点，本课题采用全基因组测序的方法开发了能够覆盖整个基因组水平的高通量分子标记，从而获得了小麦条锈菌高密度遗传图谱。此外，本人前期工作中，利用三代PacBio测序与二代Illumina测序技术相结合的方法已组装出完整性较高的小麦条锈菌基因组序列，也为本课题奠定了基础。

本课题采用自交的方法构建了小麦条锈菌有性分离群体（图1），共得到子代群体117株。通过测试一系列小麦抗条锈种质资源的抗病性表型，筛选出32个以感病小麦品种Avocet为背景的抗条锈单基因系，其抗感反应型明确。这32个抗条锈病的单基因分别为：Yr1，Yr2，Yr5，Yr6，Yr7，Yr8，Yr9，Yr10，Yr15，Yr17，Yr21，Yr24，Yr25，Yr27，Yr28，Yr29，Yr31，Yr32，Yr35，Yr43，Yr44，Yr45，Yr53，Yr64，Yr65，YrSP，YrTr1，YrExp2，Yr76，YrTre，Yr41，和YrA。将每一个子代菌系分别接种于32个含单基因抗性的小麦上，以测试其致病性，通过毒性鉴定发现，子代群体在9个抗病基因上表现出毒性分离，分别是Yr7, Yr8, Yr17, Yr27, Yr35, Yr41, Yr43, Yr44, 和 YrExp2。说明亲本菌株在这些抗病基因对应的无毒基因位点为杂合。为了定位这9个无毒基因，本课题采用Illumina HiSeq PE150平台对子代群体的117株菌系进行了全基因组测序，平均测序深度为35X。将测序数据比对至课题组前期组装的参考基因组Pst93-210，从而开发了覆盖全基因组水平的分子标记。从获得的全基因组水平分子标记筛选出高质量、缺失数据少的分子标记，利用卡方检验筛选共显性的分子标记，即符合AA:AB:BB=1：2：1。利用这些高质量分子标记绘制的小麦条锈菌遗传图共含有41个连锁群，总遗传长度为7715cM。通过对比遗传图与参考基因组计算了小麦条锈菌的平均重组率在1.81±2.32cM/10kb，略高于其他植物病原真菌（0.3-1.2cM/10kb）。我们进一步利用QTL作图的方法成功定位到6个无毒基因，其中4个无毒基因定位到同一QTL，我们称之为“AvYr44-AvYr7-AvYr43-AvYrExp2 cluster”（图2）。该QTL在参考基因组上跨度约200kb，位于参考基因组Pst93-210 Contig1.022的5’端。比较基因组学分析发现，该区域在不同菌系间是高度非保守区，对于该基因组区域进一步研究将有利于揭示小麦条锈菌毒性变异的基因组学基础。本课题定位的无毒基因有利于在小麦条锈菌中克隆无毒基因，进而为了解无毒基因的功能及其与抗病基因的互作机制奠定基础。

图1. 本课题构建小麦条锈菌自交群体及毒性表型鉴定的流程

图2. 本课题定位的AvYr44-AvYr7-AvYr43-AvYrExp2 cluster. （A）显示四个无毒基因位于同一个QTL. (B) 全基因组关联分析显示该QTL位于参考基因组的Contig1.022. (C)三个小麦条锈菌基因组的比较显示QTL所在位置仅在Pst93-210存在，为非保守区。（D）该QTL所在Contig为不存在GC含量或SNP密度偏好。

在该文章中我们还初步探讨了以下问题，值得后续详细研究，如：（1）小麦条锈菌的遗传重组率在基因组上是非均匀分布的，基因组上是否存在交换热点（hotspots），引起交换频繁的机制如何，是否与特定的genomic environment有关；（2）无毒基因簇“AvYr44-AvYr7-AvYr43-AvYrExp2”所在基因组区域有何特点，是否是在端粒临近区域，是否属于“two-speed genomic region”，这些特点是否更有利于其变异；后续研究表明，该无毒基因簇位于小麦条锈菌一条染色体的端粒序列，距离端粒重复序列仅20Kb；（3）决定无毒基因簇“AvYr44-AvYr7-AvYr43-AvYrExp2”功能的关键基因是哪些，其功能为何；（4）虽然本课题运用了覆盖全基因组的分子标记，但仍然有三个无毒基因未能定位至基因组，其原因值得进一步探究。

2020年6月18日，该研究成果以” An Avirulence Gene Cluster in the Wheat Stripe Rust Pathogen (Puccinia striiformis f. sp. tritici) Identified through Genetic Mapping and Whole-genome Sequencing of a Sexual Population””为题发表在mSphere上（https://msphere.asm.org/content/5/3/e00128-20）。论文第一作者是西南科技大学生命学院夏崇靖副教授和四川理工学院雷雨博士，美国农业部、华盛顿州立大学Xianming Chen和中国农科院植保所陈万权研究员为共同通讯作者，华盛顿州立大学Meinan Wang也参与了该研究。该课题获得国家自然科学基金、国家留学基金委公派留学等项目资助。